1.研究背景氯胺酮是临床上广泛使用的一种麻醉镇痛剂。因其在亚麻醉剂量下的致幻作用成为娱乐场所的新型毒品,并在全世界范围内普遍流行。在中国的中部地区,氯胺酮已成为排名第二位的常用毒品,且吸食者以青少年为主。台湾一项调查显示,氯胺酮已成为青少年的首选滥用药物。氯胺酮滥用多发生在娱乐场所中,吸食者经常在使用氯胺酮时饮用含酒精的饮品。氯胺酮和酒精均为N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的拮抗剂,通过结合NMDA受体(NMDA receptors,NMDARs),阻断谷氨酸和天冬氨酸等兴奋性氨基酸(excitatory amino acids,EAAs)的传递和改变NMDA受体功能,影响一系列的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)功能,从简单的运动到复杂的认知。有研究报道,长期注射氯胺酮可导致大鼠出现持久的行为改变,如出现明显持久的抑郁样行为,但短期注射无此效应,提示长期使用氯胺酮对脑功能的影响与短期不同。但少有实验研究氯胺酮长期使用对脑功能的影响作用,已有研究也因种属问题使结果的应用受到一定限制。更缺乏实验研究氯胺酮与酒精的合用效应。然而,长期亚麻醉剂量的氯胺酮使用以及亚麻醉剂量氯胺酮与酒精合并使用的模型更符合娱乐场所氯胺酮长期滥用和氯胺酮混和酒精滥用的现象。青春期是大脑突触重塑的关键时期,前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)和海马(hippocampus,HIP)的突触在青春期前期过度增生,到青春期后期再快速修剪。这种动态变化使青春期大脑的前额叶皮质和海马对药物的作用更加敏感。同时,大脑NMDARs的数量也在青春期达到顶峰。有研究表明,NMDARs的拮抗剂可导致发育期大脑前额叶皮质和海马的神经元大量凋亡,提示程序性细胞死亡可能是氯胺酮和酒精使用者脑损伤的原因之一。此外,发育期大脑的损伤会对成年期大脑的功能产生持久的影响,增加个体患心理疾病的风险。因此,本研究聚焦亚麻醉剂量的氯胺酮及其合并酒精长期使用对青春期个体自发运动、焦虑样行为、抑郁样行为、空间学习记忆,以及前额叶皮质和海马神经元凋亡的影响,揭示亚麻醉剂量的氯胺酮及其合并酒精长期使用对青春期个体行为和大脑损伤的影响作用。2.研究目的2.1建立亚麻醉剂量的氯胺酮长期使用对青春期食蟹猴行为和脑损伤影响的动物模型。2.2观察亚麻醉剂量的氯胺酮长期注射对青春期食蟹猴自主运动和刻板运动的影响。2.3探讨亚麻醉剂量的氯胺酮长期注射对青春期食蟹猴海马神经元凋亡的影响。2.4观察亚麻醉剂量的氯胺酮与酒精单用或合用对青春期大鼠自主运动、焦虑样行为、抑郁样行为和空间学习记忆的影响。2.5探讨亚麻醉剂量的氯胺酮与酒精单用或合用对青春期大鼠前额叶皮质和海马神经元凋亡的影响。3.材料与方法3.1不同时程亚麻醉剂量氯胺酮对青春期食蟹猴行为和海马神经元凋亡的影响3.1.1实验动物分组与模型制备 32只雄性青春期食蟹猴适应性喂养1个月后随机分成4组:对照组(CTR)、1个月氯胺酮组(1M)、3个月氯胺酮组(3M)和6个月氯胺酮组(6M),每组8只。1、3、6个月氯胺酮组分别每日经下肢内侧静脉注射1次1.0 mg/kg氯胺酮1、3、6月。对照组连续注射1.0 ml/kg的生理盐水6个月。3.1.2行为学观察 在实验第1、7、14、30、90、180天录像观察并记录给药前10 min和给药后10 min内的行走、移动、自主运动(行走+移动)和刻板运动次数。3.1.3核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测海马 CA1、CA2/3 和齿状回3个亚区的凋亡神经元。3.1.4透射电镜分析再次确认凋亡神经元 TUNEL染色观察后,将感兴趣区域切成1mm3的组织块。将组织块经脱蜡、水化、侵洗、锇酸后固定、梯度乙醇及丙酮脱水、包埋和固化后,切成厚度为50-70 nm的超薄切片,染色后透射电镜观察并拍照。3.1.5 免疫印迹法(Western blotting)检测海马 cleaved Caspase-3、Bax 和 Bcl-2蛋白的表达。3.2亚麻醉剂量氯胺酮合用酒精对青春期大鼠行为及前额叶皮质和海马神经元凋亡的影响3.2.1实验动物分组与模型制备 60只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠适应性喂养1周后随机分成6组:对照组(CTR)、低剂量氯胺酮组(LK)、高剂量氯胺酮组(HK)、酒精组(E)、低剂量氯胺酮+酒精组(LK+E)和高剂量氯胺酮+酒精组(HK+E),每组10只。对照组每天腹腔注射0.6 ml/kg生理盐水,接着灌胃与E组同等体积的自来水;氯胺酮组每天腹腔注射20 mg/kg或30 mg/kg的氯胺酮,接着灌胃与E组同等体积的自来水;酒精组每天腹腔注射0.6 ml/kg生理盐水,接着灌胃3.0 g/kg 10%w/v的酒精溶液;氯胺酮组+酒精组每天腹腔注射20 mg/kg或30 mg/kg的氯胺酮,接着灌胃3.0 g/kg10%w/v的酒精溶液。3.2.2行为学观察 在实验结束24 h后进行行为学测试,测试内容和顺序为旷场实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫和Morris水迷宫。3.2.3 TUNEL法检测前额叶皮质和海马CA1、CA2/3、齿状回3个亚区的凋亡神经元数量。3.2.4免疫印迹法检测前额叶皮质和海马的cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达。3.2.5实时定量PCR检测前额叶皮质和海马Capase-3,Bax和Bcl-2 mRNA的表达。4.实验结果4.1不同时程亚麻醉剂量氯胺酮对青春期食蟹猴行为和海马神经元凋亡的影响4.1.1氯胺酮注射后和注射前10 min内的行为学结果氯胺酮注射后10 min内,对照组在行走、移动、自主运动和刻板运动4个指标上与自身比较无统计学差异。而氯胺酮组在行走、移动、自主运动和刻板运动4个指标上与自身比较有明显的统计学差异,且氯胺酮组的行走量在3个月后显著低于第1天用药后,移动量和自主运动量6个月后显著低于第1天用药后。在自主运动和刻板运动2个指标上,前3个月用药时间和药物处理有交互作用;在行走和移动2个指标上,后3个月用药时间和药物处理有交互作用。氯胺酮注射前10 min内,对照组在行走、移动、自主运动和刻板运动4个指标上与自身比较无统计学差异。氯胺酮组在行走、移动和自主运动3个行为学指标上与自身比较均有统计学差异,且行走量和自主运动量在氯胺酮连续注射3个月后显著低于第1天用药后。同时,氯胺酮组的行走量、移动量和自主运动量在氯胺酮连续注射3个月后均显著少于对照组。在行走、移动和自主运动3个指标上,前3个月用药时间和药物处理有交互作用。在刻板运动指标上,各氯胺酮组的组内数据在不同观察日间无显著差异,所有实验组的组间数据在同一观测时间无显著性差异,且用药时间和药物处理也无交互作用。4.1.2 TUNEL检测结果 1个月氯胺酮组海马CA1、CA2/3和齿状回3个亚区的TUNEL阳性细胞数与对照组相比均无明显增加,但3个月氯胺酮组齿状回的TUNEL阳性细胞数显著高于对照组,CA1和CA2/3 2个亚区无明显改变。6个月氯胺酮组海马CA1、CA2/3和齿状回3个亚区的TUNEL 阳性细胞数均显著高于其余3组。4.1.3透射电镜分析结果 对照组海马的神经元和胶质细胞形态结构正常。1个月和3个月氯胺酮组可见少量凋亡的胶质细胞。而6个月氯胺酮组的海马,凋亡的胶质细胞明显增多,同时可见凋亡的神经元。4.1.4凋亡蛋白的免疫印迹检测结果 1个月和3个月氯胺酮组的cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达量与对照组相比均无明显改变,但6个月氯胺酮组的cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达均显著高于对照组,Bcl-2蛋白表达显著低于其余3组。4.2亚麻醉剂量氯胺酮合用酒精对青春期大鼠行为及前额叶皮质和海马神经元凋亡的影响4.2.1行为学结果旷场实验:实验各组在中央格停留时间、直立次数、修饰次数和粪便颗粒数4个指标上均无明显的组间差异。高剂量氯胺酮+酒精组的跨格数显著少于高剂量氯胺酮组和酒精组,但氯胺酮组、酒精组和氯胺酮+酒精组的跨格数与对照组相比无明显变化。双因素方差分析显示,在跨格数指标上酒精的主效应显著,且氯胺酮和酒精有交互作用。在直立次数指标上酒精的主效应显著,但氯胺酮的主效应不显著,氯胺酮和酒精无交互作用。在中央格停留时间、修饰次数和粪便颗粒数3个指标上,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。强迫游泳实验:氯胺酮组、酒精组和低剂量氯胺酮+酒精组的绝对不动时间与对照组相比无明显改变,但高剂量氯胺酮+酒精组的绝对不动时间显著高于对照组、高剂量氯胺酮组和酒精组。双因素方差分析显示,氯胺酮和酒精的主效应均显著,且氯胺酮和酒精有交互作用。高架十字迷宫:氯胺酮组、酒精组和氯胺酮+酒精组的开放臂停留时间百分比与对照组相比均无显著性改变。双因素方差分析显示,酒精的主效应显著,但氯胺酮的主效应不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。Morris水迷宫:氯胺酮+酒精组的游泳轨迹与其余4组不同,对照组、氯胺酮组和酒精组大鼠对目标象限水下平台的搜索策略为直线-趋向型,而氯胺酮+酒精组为边缘-随机型。氯胺酮组、酒精组和氯胺酮+酒精组的目标象限停留时间百分比与对照组相比均无明显改变。双因素方差分析显示,酒精的主效应显著,但氯胺酮的主效应不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。4.2.2 TUNEL检测结果在前额叶皮质,对照组、氯胺酮组和酒精组的TUNEL染色阳性细胞数无明显变化,但氯胺酮+酒精组的TUNEL染色阳性细胞数显著高于对照组、相应的氯胺酮组和酒精组。高剂量氯胺酮+酒精组的TUNEL染色阳性细胞数显著高于低剂量氯胺酮+酒精组。双因素方差分析显示,氯胺酮和酒精的主效应均显著,且氯胺酮和酒精有交互作用。在海马的CA1、CA2/3和齿状回3个亚区,实验各组的TUNEL染色阳性细胞数均无明显变化。双因素方差分析显示,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。4.2.3凋亡蛋白的免疫印迹检测结果在前额叶皮质,对照组、氯胺酮组和酒精组的cleaved Caspase-3,Bax和Bcl-2的蛋白表达量均无明显变化。但低剂量氯胺酮+酒精组的cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达显著高于对照组,高剂量氯胺酮+酒精组的cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表达显著高于对照组和酒精组。氯胺酮+酒精组的Bcl-2蛋白表达量无明显变化。双因素方差分析显示,在cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达上,氯胺酮和酒精的主效应均显著,但氯胺酮和酒精无交互作用;在Bcl-2蛋白表达上,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。在海马,实验各组的cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表达均无明显组间差异。但氯胺酮组和氯胺酮+酒精组的Bax蛋白表达均显著高于对照组,且氯胺酮+酒精组的Bax蛋白表达也显著高于酒精组。双因素方差分析显示,在Bax蛋白表达上,氯胺酮和酒精的主效应均显著,但氯胺酮和酒精无交互作用;在cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表达上,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。4.2.4凋亡基因的实时定量PCR检测结果与前额叶皮质的蛋白表达结果相同,对照组、氯胺酮组和酒精组的Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表达量均无明显改变。但高剂量氯胺酮+酒精组的Caspase-3和Bax的mRNA表达显著高于对照组。氯胺酮+酒精组的Bcl-2 mRNA表达量无明显变化。与蛋白表达不同的是,低剂量氯胺酮+酒精组的Caspase-3和Bax的mRNA表达与对照组相比无明显差异。双因素方差分析显示,在Caspase-3 mRNA表达上,氯胺酮的主效应显著,酒精的主效应不显著,氯胺酮和酒精无交互作用;在Bax mRNA表达上,氯胺酮和酒精的主效应均显著,但氯胺酮和酒精无交互作用;在Bcl-2 mRNA表达上,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。与海马的蛋白表达结果相同,实验各组的Caspase-3和Bcl-2 mRNA表达均无明显组间差异。与蛋白表达不同的是,实验各组的BaxmRNA表达也无明显组间差异。双因素方差分析显示,在Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA表达上,氯胺酮和酒精的主效应均不显著,氯胺酮和酒精也无交互作用。5.结论5.1亚麻醉剂量的氯胺酮连续注射3个月可显著抑制青春期食蟹猴的自主运动。5.2亚麻醉剂量的氯胺酮连续注射3个月可导致青春期食蟹猴大脑海马齿状回的神经元明显凋亡,连续注射6个月可导致CA1、CA2/3和齿状回3个亚区的神经元大量凋亡。提示亚麻醉剂量的氯胺酮长期使用可导致青春期大脑的海马神经元凋亡,且影响作用成时间相关性。5.3对食蟹猴连续注射1.0 mg/kg氯胺酮3至6个月可作为灵长类动物氯胺酮长期滥用的动物模型。5.4亚麻醉剂量的氯胺酮合用酒精可导致青春期大鼠出现抑郁样行为,但单独使用无此效果,提示氯胺酮合用酒精会增加患抑郁症的风险。5.5亚麻醉剂量的氯胺酮合用酒精可导致青春期大鼠前额叶皮质神经元凋亡,但单独使用无此效果,提示氯胺酮合用酒精会加重前额叶皮质神经元的凋亡损伤。5.6亚麻醉剂量的氯胺酮和酒精无论单用还是合用对青春期大鼠的海马神经元均无明显的凋亡损伤作用。结合前额叶皮质的实验结果,提示青春期大脑的前额叶皮质比海马更容易受到氯胺酮和酒精的损伤。