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目的:本研究拟从细胞分子水平研究维生素K2(VK2)对食管癌细胞增殖、凋亡、细胞周期以及相关蛋白表达的影响,进一步探讨VK2的抗肿瘤作用及其可能的作用机制,为食管癌综合治疗寻找新的抗肿瘤辅助药物。
方法:1采用MTT法分析不同浓度(10、20、40、80、160μmol/ml)VK2分别作用24、48、72小时后,人食管癌细胞Eca-109增殖反应的变化,选择最佳的实验浓度和作用时间;
2采用倒置相差显微镜及透射电镜(TEM)观察40μmol/ml VK2作用72h后,Eca-109细胞形态学变化;
3采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测不同浓度(20、40、80μmol/ml)VK2作用72h后,Eca-109细胞凋亡、细胞周期分布情况以及Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化情况;
4采用免疫组化技术检测Eca-109细胞经不同浓度(20、40、80μmol/ml)VK2作用72h后,Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化;
结果:1 MTT检测结果显示:10、20、40、80、160μmol/ml VK2对Eca-109细胞增殖具有抑制作用。不同浓度VK2处理细胞24、48、72h后,各实验组抑制率均有不同程度升高,与对照组相比,有显著性差异(p＜0.05)。随着VK2浓度的增加、作用时间的延长,抑制率逐渐升高。VK2在10～160μmol/ml浓度范围内对Eca-109细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。不同浓度(10、20、40、80、160μmol/ml)VK2作用72小时对Eca-109细胞的增殖抑制率依次为:24.59±2.140％、40.14±2.311％、54.84±2.095％、68.69±1.059％、77.65±2.980％,抑制率以160μmol/ml VK2作用72h为最高,可达77.65±2.980％。VK2对Eca-109细胞作用72h的半数抑制浓度IC50值在40μmol/L附近。
2倒置相差显微镜下观察细胞形态变化结果显示:空白对照组细胞生长良好,细胞呈梭形或多角形,形态饱满;VK2(40μmol/ml)处理72h后的细胞出现贴壁不良,细胞皱缩,破裂,呈圆形或卵圆形,细胞胞浆中出现空泡。
3透射电镜结果显示:在放大4000～15000倍的透射电镜下观察,正常Eca-109细胞胞膜完整,表面有大量绒毛样突起。细胞核大、形态不规则,核仁大而明显,内染色质均匀分散,密度一致,细胞质内细胞器丰富,可见内质网、线粒体、核糖体等细胞器,结构清晰完整。VK2(40μmol/ml)处理72h后的Eca-109细胞呈现不同程度凋亡性改变:细胞体积缩小,胞核局部向外呈锐角突起,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月形小体,有的出现核固缩和核碎裂,偶见凋亡小体。
4流式细胞术分析结果显示,VK2能使Eca-109细胞发生凋亡和生长周期阻滞。Eca-109细胞经不同浓度(0、20、40、80μmol/ml)VK2处理72h后,流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰,凋亡百分率分别为3.92％、6.21％、14.25％、23.58％,随VK2浓度的增大而逐渐升高。各处理组与空白对照组相比及各处理组之间比较均有显著性差异(p＜0.05);Eca-109细胞经不同浓度VK2处理72h后,细胞周期发生变化,空白对照组细胞主要分布在S期(45.53％),其次分布在G0/G1期(40.63％),少数分布在G2/M期(13.47％)。经20、40、80μmol/ml VK2处理的细胞S期明显减少,从45.53％下降至28.73％,G0/G1期细胞数则明显增加,从40.63％上升至55.70％,各处理组与对照组比较,差异具有显著性(p＜0.05),提示细胞生长周期阻滞在G0/G1期;流式细胞仪半定量检测Eca-109细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达结果显示:0、20、40、80μmol/ml VK2作用Eca-109细胞72h后,Caspase-3蛋白的荧光指数FI值均随处理浓度增大而逐渐升高,而Bcl-2蛋白的荧光指数FI值随处理浓度增大而逐渐减少。Bax蛋白的荧光指数FI值随处理浓度增大而无明显变化。对于Caspase-3、Bcl-2蛋白,比较其处理组和空白对照组的FI值,均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),而Bax蛋白处理组与空白对照组无显著性差异(P＞0.05)。
5免疫组化检测结果显示:Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白主要表达于细胞浆,可见棕褐色着色。Caspase-3蛋白的细胞阳性百分率随VK2浓度的增大而逐渐升高,Bcl-2蛋白的细胞阳性百分率则随药物浓度的增大而逐渐减小,Bax蛋白的细胞阳性百分率却随药物浓度的增大而无明显变化。对于Caspase-3、Bcl-2蛋白,比较其处理组和空白对照组的的细胞阳性百分率,均有极显著性差异(P＜0.01),而Bax蛋白处理组与空白对照组无明显差异(P＞0.05)。
结论:1 VK2体外能明显抑制人食管癌细胞株Eca-109细胞的增殖。
2 VK2对人食管癌细胞株Eca-109的抑制作用可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关,VK2能使Eca-109的生长周期阻滞在G0/G1期。
3 VK2可能是通过升高Caspase-3、降低Bcl-2而发挥抗肿瘤作用的。