论文部分内容阅读
大自然选择磷元素作为生命活动的调控中心,磷元素的引入可以激活天然-α-氨基酸羧基的活性,改变天然-α-氨基酸的化学性质和物理性质,赋予其重要的特性。例如,良好的表面活性能够使磷酰化氨基酸形成稳定的LB膜；成肽的性质为仿生化的研究提供了理论依据；广泛的生物活性在食品工艺中对于提高食品功能性质具有重要的应用前景。然而,目前,磷酰化氨基酸这些重要的性质在科学领域的应用未得到深入的开发,关于非天然脂肪酸链氨基酸的磷酰化及其性质的研究未有报道,因而探讨新型、绿色、稳定的磷酰化氨基酸分子自组装成囊泡的物理行为及与胰蛋白酶的相互作用在食品加工技术、食品药物载体、生物膜模拟等科学领域的研究具有重要的意义。本课题选择非天然脂肪酸链L型氨基酸为底物,自主合成了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸,运用核磁共振波谱法(NMR)、电喷雾质谱法(ESI-MS)、高效液相色谱法(HPLC)等对其结构进行了表征。并利用动态光散射仪(DLS)、等温滴定量热仪(ITC)考察了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸的临界聚集浓度(CAC)及温度对CAC的影响；通过傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)对自聚成肽的性质进行了研究,发现非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸及二肽的自聚集物理行为。另一方面,由于胰蛋白酶在食品中的广泛应用性及磷酰化氨基酸的重要生物活性,它们之间相互作用的研究对于改善食品功能性质具有重大的意义,因此通过三维荧光光谱仪探讨了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸与生物大分子物质(胰蛋白酶)之间的相互作用。主要研究内容有：(1)非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸分子的设计与合成本课题设计了侧链长度不同的四种非天然脂肪酸链氨基酸(L-2-氨基戊酸、庚酸、辛酸、壬酸)及其二肽分子,选择赵玉芬院士研究小组发现的亚磷酸二异丙酯四氯化碳水相法对四种底物进行磷酰化,优化柱层析条件进行分离和纯化。通过核磁共振波谱仪(NMR)、电喷雾质谱仪(ESI-MS)、高效液相色谱仪(HPLC)对合成产品结构表征,结果表明,产品纯度能够达到实验所需要求。同时,实验结果证明了四氯化碳水相合成法同样适用于非天然脂肪酸链氨基酸的磷酰化,对于其它非天然氨基酸的磷酰化合成方法的选择具有重要的参考意义。(2)非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸物理化学性质的研究由于一定链长的磷酰化氨基酸两亲分子具有良好的表面活性,因此利用等温滴定量热法(ITC)、电导率法(DLS)对磷酰化戊酸、庚酸、辛酸、壬酸的临界聚集浓度(CAC)进行了考察,磷酰化戊酸、庚酸在25℃能够溶解,磷酰化辛酸、壬酸在50℃能够溶解。结果表明,25℃时N-磷酰化戊酸、庚酸的CAC分别为0.0806mmol/L、0.0125mmol/L。N-磷酰化辛酸、壬酸50℃时其CAC分别为0.2029mmol/L、0.2397mmol/L。结果表明非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸具有良好的表面活性。L-2-NH2-戊酸-L-2-NH2-戊酸、L-2-NH2-庚酸-L-2-NH2-庚酸在25℃的CAC值分别是16.1045mmol/L,11.8951mmol/L。根据临界聚集浓度值为囊泡制备的浓度选择提供参考。同时,电导率法考察了不同温度(25℃、30℃、40℃、50℃)对磷酰化氨基酸的CAC的影响,结果表明随着温度的升高,CAC均呈上升的趋势。同时,傅里叶变换红外光谱(FT-IR)溴化钾压片法对非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸在异丙醇中的动力学变化进行了研究,证明了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸在没有催化剂和缩合剂的异丙醇溶液中能够成肽,DIPP-L-2-NH2-戊酸和DIPP-L-2-NH2-庚酸的自聚成肽反应时间在10小时左右,而DIPP-L-2-NH2-辛酸和DIPP-L-2-NH2-壬酸的自聚成肽反应时间在5小时左右。随着氨基酸侧链长度的增加,其自聚成肽的时间逐渐减少。利用非天然磷酰化脂肪酸链化氨基酸在异丙醇溶剂中自聚成肽性质制备囊泡(反应温度50℃、转速10r/min、pH=2-3),通过电子显微镜(TEM)对其自聚形态进行表征,观察到稳定的单层囊泡的聚集体,利用设计的二肽分子作对照实验对形成囊泡的行为进行了更深入的探索,从而实现了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸自组装成囊泡的行为。为构建囊泡的自复制、自催化稳定体系提供了重要的研究基础。(3)非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸与胰蛋白酶荧光猝灭研究胰蛋白酶能够对食品蛋白质改性,从而提高食品的功能性质,目前已经广泛应用于食品领域中。但是,关于磷酰化氨基酸对胰蛋白酶抑制作用的研究鲜有报道。胰蛋白酶具有荧光性,本文借助于三维荧光光谱法详细研究了非天然L型脂肪酸链氨基酸磷酰化前后与胰蛋白酶的相互作用。实验结果表明,温度从25℃升高到40℃时,胰蛋白酶的构型未发生改变。25℃时3mmol/L的L-2-氨基戊酸、庚酸、辛酸及壬酸不能使蛋白酶的荧光强度减弱,而3mmol/L的磷酰化氨基酸对胰蛋白酶能够产生荧光猝灭。同时,浓度不同、侧链长度不同的同系列磷酰化氨基酸对胰蛋白酶的荧光猝灭效应均不同。随着N-磷酰化氨基酸侧链长度的增长及N-磷酰化庚酸浓度的增大(Ommol/L、1mmol/L、3mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L),胰蛋白酶的荧光强度均明显降低,25℃时Fo/F与N-磷酰化氨基酸呈良好的线性关系,线性相关系数R2=0.994,Stern-Volmer曲线表明其荧光可以被完全猝灭。说明氨基酸的磷酰化能够增加与胰蛋白酶的弱相互作用,提高亲和力。本课题通过自主设计、合成四种非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸分子,利用磷酰化氨基酸重要的特性,研究了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸及其二肽自组装成囊泡的物理行为及对胰蛋白酶的荧光猝灭效应。促进了非天然磷酰化脂肪酸链氨基酸化学性质、生物活性的研究进展,为今后囊泡的自复制、自催化稳定体系的构建提供了有力的基础和参考,有利于探讨新型非天然N-磷酰化脂肪酸链氨基酸在食品工艺、药物控释、生物膜模拟等方向的研究应用。