禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。H9亚型AI近年来在我国部分地区流行，造成了养禽业尤其是养鸡业的严重损失。目前预防AI还没有理想的疫苗，现有的疫苗主要有灭活油乳剂疫苗，但其使用受到一些限制：这一途径生产的疫苗成本高，疫苗应用后会严重影响现有技术条件下的禽流感疫情监测，并且存在安全隐患，可能造成人为散毒。一个更好的选择是重组鸡痘病毒疫苗。AIV的血凝素(hemagglutinin,HA)是主要的保护性抗原，许多株表达各种亚型AIV—HA基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫后均可对相应亚型的不同毒株(包括高、低致病力毒株)的攻击产生近100％的免疫保护性，而且重组病毒载体疫苗应用后不会干扰以传统检测方法为基础的禽流感疫情监测，具有较好的应用前景。 本实验室根据近年来禽流感血清学调查的结果，选用优势株F株(H9N2)研制成功表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗，本研究中，以此重组鸡痘病毒载体疫苗在生产工艺、遗传稳定性和免疫保护效力三方面开展研究。 1 生产工艺的初步研究 对重组鸡痘病毒疫苗的生产工艺的初步研究主要是根据鸡痘细胞苗的生产工艺进行，在4个主要环节上进行考察：细胞培养、病毒接种比例、后处理以及冻干步骤。 1．1 细胞培养：采用胰酶连续消化方法生产鸡胚成纤维细胞，所生产的细胞产量可稳定在2亿细胞/10日龄胚以上，每3000ml转瓶仅需5-6枚鸡胚即可形成致密单层。 1．2 病毒接种比例：在3000ml和500ml转瓶体系中采用固定细胞数量连续改变病毒接种比例的方法进行试验，培养72小时左右，此时已可观察到80％以上的细胞收缩或变圆，即可收获计数。实验结果表明，0.2-0.3PFU/细胞的接种比扬州大学硕士学位论文之 例较适合，可获得较高的病毒产量。1 .3后处理:收获时弃去大部分上清，针对细胞团块采用低温磁转子高速搅拌，再 冻融1一2次，或超声波裂解后，置一20℃/-70℃保存备用。经过搅拌、冻融或超 声波裂解处理，细胞团块得到分散，溶液中细胞碎片分布均匀且直径很小。 计数后发现，经过搅拌、冻融或超声波裂解处理后所得计数结果基本一致， 而未经搅拌处理的样品的计数结果存在10一100倍差异。冻融前后计数结果显 示，冻融1一3次后，病毒空斑数略有上升，冻融3次以上，病毒空斑数大幅下 降。结果表明:收获后经过搅拌、冻融或超声波裂解处理有助于使产品匀质， 但冻融操作次数不宜多。1.4冻干步骤:将冷冻保存的病毒原液解冻后，按适当比例与冻干保护剂混合，以 2 mF瓶量分装于无菌小瓶中，置冻干机内冻干。冻干结束后，抽样计数检测。 结果显示，冻干后制品所含的病毒抗原效价高于冻干前制品的效价。2遗传稳定性研究 为考察此重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性，将表达Hg亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次在细胞培养上的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗在SPF鸡上进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1 .7Kb外源基因片段，酶切位点(第30代)与原始代次相同;各代次外源基因序列与原始代次序列相比，仅有1个碱基可能发生变化，不涉及氨基酸的变化;免疫荧光试验显示各代次均有显著表达;各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的Hl抗体效价(fo乡)逐渐上升;攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。实验结果表明:此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未有变化，免疫保护效力亦与原代一致。3免疫保护效力试验 应用表达Hg亚型禽流感病毒(avian恤~vin巧沪JV)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒疫苗及其传代后的第加、30代疫苗于颈部皮下免疫5日龄SPF鸡群，于免疫后第7、10、14、20天采血测HI抗体效价，并于免疫后第21天攻毒，攻毒后第2、5、7、9、11、13天进行泄殖腔棉拭子采样，接种鸡胚测排毒情况.各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价逐渐上升，但不同免疫剂量组冀德君:重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性研究及免疫保护效力试验间、不同传代代次间有差异;攻毒后第5天各免疫组排毒的鸡数与对照组相比显著减少，且各免疫组间、同亚型不同攻毒毒株组间无差异。重组疫苗组、灭活油乳剂苗组和对照组在攻毒后显示出不同的排毒规律，其中重组疫苗组排毒最少，下降最快。实验结果表明:本实验室研制的表达Hg亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒载体疫苗具有较高的免疫保护效力，不低于灭活油乳剂苗，而且在抑制早期排毒、防止群内传播方面优于灭活油乳剂苗，为低致病性禽流感的防制提供了又一有用的工具。 综上所述，本实验室研制的表达Hg亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒载体疫苗在病毒抗原的大规模扩增、遗传稳定性及免疫保护效力这三方面均可达到《兽医生物制品检验规程》的标准