研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%～20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下(Diminished Ovarian Reserve,DOR)是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1～6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素(FSH、LH、E2)含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素(AMH、INHB、FSH、LH、E2)水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数(P<0.05),下调血清FSH、LH水平(P<0.01),并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01),减少闭锁卵泡计数(P<0.01)。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高(P<0.01),血清AMH和INHB水平上升(P<0.01),FSH、FSH/LH值下降(P<0.01,P<0.05);补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数(P<0.01,P<0.05,P<0.01),减少次级卵泡和闭锁卵泡数目(P<0.01),同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值(P<0.01)。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值(P<0.01),同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平(P<0.01),并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比(P<0.01)。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平(P<0.05),增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值(P<0.05,P<0.01),同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值(P<0.01)。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量(P<0.05,P<0.01),增加CAT、GSH-Px和SOD活力(P<0.01)。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平(P<0.05),同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率(P<0.01)。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高(P<0.01),但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。