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目的构建针对多效蛋白(pleiotrophin,PTN)基因的小干涉RNA(siRNA)慢病毒表达载体并观察其对人小细胞肺癌H446细胞株PTN表达抑制及对细胞生长及凋亡的影响。同时观察PTN基因沉默后,人小细胞肺癌H446细胞中与血管新生、肿瘤生长、侵袭过程相关的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、angiomotin(Amot)、schlafen5(Slfn5)和金属蛋白酶9(MMP-9)4种基因的表达变化。构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤模型,观察PTN基因RNA干扰病毒对移植瘤瘤体生长的抑制作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测PTN在H446细胞中的表达。设计四对针对PTN基因的小发夹RNA(shRNA)序列,与Plvthm载体连接,构建慢病毒表达载体LV(lentiviral)-shPTN,连接产物转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆测序鉴定。再用LV-shPTN与pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,小量包装与纯化产生慢病毒颗粒。病毒感染H446细胞后,用荧光定量PCR及Western blotting检测细胞中PTN基因的表达。选择对PTN基因干扰效率最高的候选慢病毒载体进行大量包装、纯化及病毒滴度测定。将获得的病毒感染H446细胞,实验分为正常未干扰细胞组、感染空对照病毒的阴性对照组、感染PTN基因RNA干扰病毒抑制组、化疗组及感染PTN基因RNA干扰病毒抑制加化疗组。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞生长,流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡。RT-PCR检测未干扰细胞组、阴性对照组、PTN抑制组和PTN抑制加化疗组细胞中Amot、Slfn5、MMP-9和VEGF的表达。采用H446细胞直接皮下接种的方法构建人小细胞肺癌H446细胞裸鼠异种移植瘤动物模型,分为正常未干扰组,化疗(顺铂)组,干扰PTN的病毒组,化疗+干扰PTN的病毒组和阴性病毒对照组。瘤体附近多点皮下注射病毒或顺铂后,分别于第1、2、7、15天测量瘤体体积。并在治疗第15天分别用RT-PCR和Western blot方法检测正常未干扰组、阴性病毒对照组及干扰PTN的病毒组中PTN的表达。结果RT-PCR和Western blot检测结果均表明,PTN基因在H446细胞中表达显著高于H460细胞。构建的慢病毒载体经测序验证正确。所构建的shRNA序列(GCAGCTGTGGATACTGCTGAA)对PTN mRNA的抑制效率为72%,对PTN蛋白的抑制效率为59.2%。大量包装与纯化后病毒滴度为1×108 TU/ml。PTN基因抑制组的H446细胞活力显著低于正常未干扰组和阴性对照组细胞,基因抑制联合化疗组较单纯基因抑制组及化疗组细胞活力下降,细胞凋亡率增高,并具呈浓度依赖性。PTN基因沉默后,H446细胞中Slfn5和MMP-9的表达分别较阴性对照组上调了165.1%和47.3%,而Amot和VEGF的表达分别较阴性对照组下调了33.1%和26.6%。协同化疗后,上述趋势更为明显。动物实验瘤体组织中干扰PTN病毒组PTN mRNA和PTN蛋白的表达明显低于正常未干扰组及阴性病毒对照组,抑制率为分别为39%及28%。干扰PTN病毒组瘤体体积显著小于正常未干扰组及阴性病毒对照组,若协同化疗则瘤体缩小更明显。结论构建PTN RNA干涉载体,转染后可有效降低H446细胞PTN的转录和表达,抑制H446细胞的生长并促进其凋亡,并可进一步影响H446细胞增殖和转移相关基因的表达变化。动物实验也显示针对PTN基因靶向治疗可显著抑制移植肿瘤在体内的生长,若与化疗协同则抑制作用更强。有望为小细胞肺癌基因治疗提供一种选择的治疗手段。