论文部分内容阅读
目的： 1、建立人脂肪间充质干细胞(Human adipose tissue-derived stem cells，hASCs)分离、鉴定，培养大量高纯度的hASCs。 2、建立磁珠分选高纯度CD4+T细胞，探讨hASCs对多发性硬化(Multiplesclerosis，MS)患者外周血Th17细胞的免疫调控作用。 3、探讨hASCs免疫调控可能机制是否与LIF有关。 方法： 1、从抽脂手术患者中得到废弃的脂肪组织，分离、纯化hASCs，在倒置显微镜下观察细胞形态学特点。用流式细胞仪检测细胞表面分子CD44、CD105、CD29、CD73、CD31、HLA-DR的表达水平进行鉴定，并且比较冻存前后生物学性状及MTT比色法描绘生长曲线的增殖能力变化。 2、采用密度梯度离心法分离MS患者外周血单个核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cells，PBMCs)，选用免疫磁珠分析CD4+T细胞，使用MiniMACS磁珠分离系统分离出CD4+T细胞，流式细胞仪检测分选前后CD4+T细胞所占的比例。分离纯化的CD4+T细胞后，用抗CD3、抗CD28刺激细胞活化，加入细胞因子使向Th17细胞极化，并加入不同比例的hASCs(hASCs∶CD4+T分别为1∶4、1:10)共培养4d，流式细胞术检测共培养后Th17细胞占CD4+T细胞的比例，RT-PCR检测CD4+T细胞表面受体IL-6R、IL-23R、LIFR，核转录因子RORγt以及hASCsLIF mRNA水平变化; 3、选择一个适合的比例，并设立添加anti-LIF组，流式细胞术检测Th17细胞比例，ELISA法检测共培养体系上清液中LIF的表达;RT-PCR检测IL-6R、RORγ t mRNA水平变化。探讨hASCs对MS的Th17细胞免疫调节作用及其可能机制。 结果： 1、初分离的hASCs光镜下形态呈长梭形、三角形，呈簇状贴壁生长，经2-3次传代后细胞形态均得纯化。冻存前后hASCs生长曲线无显著差异，均为“S”形曲线增殖生长，约7d左右到达平台期。流式细胞术鉴定可基本判定为hASCs，且冻存前后hASCs各表面分子标志物阳性率结果差别无统计学意义(P＞0.05)。 2、密度梯度离心法可从外周血高效获得PBMCs，流式细胞术分析显示CD4+T细胞在PBMCs中所占比例为25-35％。PBMCs经免疫磁珠法分选，经流式细胞术分析，分选后所得的细胞大部分CD4+T细胞，纯度高达90％以上。光学显微镜下观察，共培养后CD4+T淋巴细胞悬浮生长，而hASCs呈贴壁生长。流式细胞仪检测Th17细胞结果提示，1∶4组、1∶10组中Th17细胞占CD4+T细胞的比例下降，且存在高浓度抑制效应;RT-PCR分析发现CD4+T细胞共培养后RORγt、IL-6R、IL-23RmRNA的表达水平下降;共培养后CD4+T细胞LIFR与hASCs细胞LIF mRNA表达水平均升高; 3、加入anti-LIF后，Th17细胞比例回升至对照组水平;RT-PCR分析RORγt、IL-6R mRNA的表达水平回升;ELISA检测各组LIF的水平发现，共培养组LIF分泌均较CD4+T、hASCs增多，加入anti-LIF后明显减少;以上结果均有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1、脂肪组织来源广泛、取材容易，hASCs可在体外高纯度培养和扩增，冻存前后一般生物学特性无明显变化。 2、免疫磁珠法分选外周血可获得高纯度CD4+T细胞，hASCs可抑制MS患者Th17的分化。 3、hASCs免疫调控机制可能与其分泌LIF，通过IL-6/LIF轴竞争性抑制有关。