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2-苯乙醇,简称2-PE,是一种具有持久淡雅玫瑰香气的芳香醇类物质,广泛应用于食品、化妆品和烟草行业。天然2-苯乙醇主要存在于显花植物的花果及其提取的精油中,但因其浓度低,提取困难,目前2-苯乙醇主要还是通过化学方法进行合成。虽然化学合成的成本低、产量高,但存在着环境污染严重,产生有毒副产物等弊端,不符合现代消费者崇尚“天然、安全和环保”的绿色消费理念。由微生物转化制备的香料,被称为天然等同香料,符合“绿色生产”的安全标准,而且其构型、手性单一,有助于香气品质的提高,是近年来天然香料制备重要发展方向。本文以L-苯丙氨酸（L-Phe）高产大肠杆菌Escherichia coli.M4为底盘,构建苯乙醇从头合成工程菌株,主要研究内容如下:（1）大肠杆菌引入异源苯乙烯衍生途径的研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在大肠杆菌中引入一种新的2-苯乙醇合成替代途径—苯乙烯衍生途径。该途径由胞内L-苯丙氨酸开始合成,共涉及四种异源酶,分别由pal2、fdc1、sty AB、sty C编码。将这四个关键基因整合到E.coli M4基因组上,获得无质粒工程菌株E.coli BYC2(E.coli M4;gap C::PT7-pal2-fdc1;yee P::Ptrc-sty AB-sty C),测序结果表明,该途径成功引入E.coli M4中。但经摇瓶发酵后,在发酵液中检测到痕量2-苯乙醇,发现该工程菌株2-苯乙醇合成能力水平较差,说明苯乙烯衍生途径并不适用于该工程菌株的改造。（2）大肠杆菌引入异源艾利希途径的研究进一步尝试在苯丙氨酸高产大肠杆菌E.coli M4中引入另一种2-苯乙醇合成途径—艾利希途径;该途径同样由胞内L-苯丙氨酸开始合成,涉及ARO10基因编码的苯丙酮酸脱羧酶以及内源的醇脱氢酶。通过POE-PCR原理成功构建了含有不同重组质粒的工程菌株E.coli BYC3（E.coli M4;p Trc99a-ARO10）、E.coli BYC4（E.coli M4;p STV28-ARO10）、E.coli BYC5（E.coli M4;p WSK29-ARO10）和ARO10基因密码子优化后的工程菌株E.coli BYC6（E.coli M4;p Trc99a-ARO10*）。摇瓶发酵结果表明含有高拷贝表达质粒菌株E.coli BYC3产量最高,发酵72 h后2-苯乙醇产量达761.20±20.03 mg/L,产率0.031g/g葡萄糖;即ARO10基因表达成功且具有较高的催化水平。AR010基因密码子优化后的工程菌株E.coli BYC6苯乙醇产量反而大幅度降低,推测是密码子优化后影响了苯丙氨酸脱羧酶的构象及稳定性,优化后的基因并不适用于该工程菌株的改造。（3）艾利希途径的强化采用代谢工程研究策略,构建2-苯乙醇大肠杆菌生物合成细胞工厂。通过敲除竞争代谢途径fea B基因构建工程菌株E.coli BYC7（E.coli M4;Δfea B;p Trc99a-ARO10）,2-苯乙醇产量为1041.03±34.31 mg/L,比工程菌株E.coli BYC3提高了35%。之后在不同IPTG浓度诱导下,确定添加0.5 mmol/L IPTG诱导剂,工程菌株E.coli BYC7合成2-苯乙醇能力最佳,2-苯乙醇产量高达2.15±0.021 g/L。在此基础上,为提高前体物质PEP的供给敲除了crr基因,构建了工程菌株E.coli BYC8（E.coli M4;Δfea B;Δcrr;p Trc99a-ARO10）,与工程菌株E.coli BYC3对比,2-苯乙醇产量提高了20%,在0.5 mmol/L IPTG诱导下,产量达到2.12±0.018 g/L。为进一步减少菌株培养过程中对抗生素及诱导剂的使用,基于艾利希途径,重新构建了一株无质粒2-苯乙醇合成工程菌株E.coli BYC9(E.coli M4;Δfea B;Δcrr;yee P::Ptrc-ARO10),通过摇瓶发酵验证2-苯乙醇产量可达1.61±0.104 g/L,葡萄糖转化效率为0.071 g/g,是目前大肠杆菌从头合成2-苯乙醇的较高水平。（4）苯乙醇发酵工艺的初步探索将无质粒工程菌株E.coli BYC9通过5 L发酵罐进行2-苯乙醇生物合成小试工艺的初步探索。通过两种补糖策略,在持续补糖条件下确定了该菌株具备高产合成2-苯乙醇的前提条件;在分批补糖策略下,确定控制通气量为2 L/min,恒定转速400 rpm的条件下,2-PE产量约为1.8 g/L;为后续工业化生产奠定了理论基础。