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2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2）可以引发人和猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,是一种人畜共患病原菌。2型猪链球菌病对猪的危害极大,猪群发病死亡率高。本研究在2型猪链球菌谷氨酰胺合成酶基因△GlnA缺失株的基础上构建了猪链球2型△GlnA/ECEl双基因缺失株,并筛选出了能稳定分泌ECE1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为猪链球菌基因工程弱毒疫苗的研制和猪链球菌病诊断方法的建立提供了参考基础,主要研究内容有：1.2型猪链球△GlnA/ECEl双基因缺失株的筛选将带有ECE1上下游同源臂的重组质粒电转化S. suis SC19△GlnA感受态细胞,经过抗性培养基筛选和PCR的鉴定,最后成功获得S. suis SC19△GlnA/ECE1双基因缺失株。2.2型猪链球△GlnA/ECEl双基因缺失株的生物学特性研究实验选取S. suis SC19、S. suis SC19△GlnA、S. suis SC19△GlnA/ECE1三个菌株同时进行相同条件下的实验。结果显示△GlnA/ECE1双基因缺失菌株在TSA固体培养基上的菌落形态大小没发生变化,在加绵羊血的TSA培养基上的溶血能力也没有变化,并且在TSB培养基中传代能稳定生长。测定三个菌株随时间变化的菌液的吸光度值的变化,并绘制变化曲线,结果显示△GlnA缺失株生长速度变慢,△GlnA/ECE1缺失株与△GlnA缺失株相比没有变化。用国际认定的法国梅里埃API20 Strep标准检测三个菌株的生化特性,结果显示△GlnA/ECE1缺失株和△GlnA缺失株没有差异,只是与野毒株相比其中a-galactosidae检测变为阴性。△GlnA/ECE1缺失株对Hep-2的粘附和毒性能力与△GlnA缺失株对比略有所下降,但是与野毒株相比下降明显。3.2型猪链球△GlnA/ECE1双基因缺失株对CD1小鼠致病力的变化选取S. suis SC19、S. suis SC19△GlnA、S. suis SC19△GlnA/ECE1三个菌株同时进行相同条件下的动物实验。实验结果显示S. suis SC19△GlnA/ECE1双基因缺失株感染CD1小鼠的LD50明显高于两个亲本株,其感染所致的发病率和死亡率与两个亲本株相比也下降很多。感染后的小鼠不同组织随时间变化的带菌量曲线图显不,△GlnA/ECE1双基因缺失株感染组小鼠的组织带菌量比野毒株感染组明显下降很多,与△GlnA基因缺失株感染组相比略有降低。△GlnA/ECE1突变株感染组小鼠脑和肺组织切片在显微镜下观察都正常,基本没有可视病理损伤；而△GlnA基因敲除突变株感染组脑组织基本无可观病理变化,但肺组织有炎性细胞渗出病变；野毒株感染组的小鼠脑和肺组织均发生了严重的病理变化。4.内皮素转化酶1在大肠杆菌系统中的高效表达根据GenBank上SSU050153的基因序列设计PCR扩增内皮素转化酶1的全长基因序列的引物,成功构建了表达载体pET-28a ECE1,然后转化大肠杆菌BL21,经过酶切鉴定正确后保存备用。实验通过不同的条件下的摸索,最终确定在37℃摇床上IPTG （0.4mmol/mL）诱导表达4小时为ECE1表达条件,并确定可溶性表达产物与包涵体蛋白都有产生,为了纯化方便实验进行纯化可溶性表达的蛋白。5.内皮素转化酶1单克隆抗体的制备将诱导表达后纯化的ECE1蛋白作为抗原免疫Babl/c小鼠制备免疫脾细胞,用细胞融合技术与SP2/0骨髓瘤细胞融合。以ECE1蛋白为包被抗原用间接ELISA的方法筛选融合后的阳性细胞株,用有限稀释的方法克隆三次后最终获得六株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。分别以SC19株菌体和△GlnA/ECE1突变株菌体为抗原,制备的小鼠腹水单抗为一抗分别进行western blot验证实验,结果显示有两株单抗细胞株与SC19株反应为阳性,命名为SE3和SE6。所有细胞株单抗与△GlnA/ECEl突变株反应为阴性。