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研究一:足细胞TGF-β损伤模型中雷公藤甲素保护作用与miR-30s的关系目的:为探讨雷公藤甲素对足细胞的保护机制,我们用TGF-β足细胞损伤模型研究雷公藤甲素与足细胞关键因子miR-30s的关系。方法:采用体外TGF-β致足细胞损伤模型,观察雷公藤甲素对足细胞的保护作用。雷公藤甲素与足细胞预孵育30 min后,加入含有5 ng/mL TGF-β1的培养基处理足细胞24 h;用 Western 检测 Smad2/3、MAPK p38、NF-KB p65、NFATC3、Synaptopodin 等分子的活化(磷酸化)或表达水平的变化;用Annexin V流式细胞分析检测足细胞凋亡:用荧光标记的鬼笔环肽染色法检测足细胞骨架损伤;用Q-PCR分析检测miR-30s的表达。另外,分离小鼠的肾小球,在有或无雷公藤甲素存在的情况下给与TGF-β1处理,以验证其对miR-30s表达的影响。同时,分离大鼠的肾小球,经TGF-β与雷公藤甲素处理后用Western检测雷公藤甲素对Smad2/3磷酸化水平的影响。结果:雷公藤甲素可以抑制TGF-β诱导的p38、p65和NFATC3分子的活化以及足细胞凋亡的发生,抑制TGF-β引起的足细胞骨架损伤。Q-PCR结果显示,雷公藤甲素可以完全逆转TGF-β诱导的miR-30s的表达下调,提示雷公藤甲素通过稳定miR-30s的表达而对足细胞起保护作用。最后,TGF-β诱导的Smad2/3的磷酸化水平能被雷公藤甲素所抑制。在分离的肾小球中,雷公藤甲素可以抑制TGF-β诱导的miR-30s的下调以及Smad2/3的磷酸化。结论:1)已有研究证明miR-30s为足细胞生存以及结构和功能所必需,而TGF-β能通过下调miR-30s损伤足细胞。本研究发现雷公藤甲素能完全防止TGF-β诱导的miR-30s下调,逆转TGF-β造成的足细胞损伤,证明雷公藤甲素通过阻止miR-30s下调发挥足细胞保护效应;2)有研究表明TGF-β经由Smads通路下调miR-30s,我们发现雷公藤甲素能抑制TGF-β诱导的Smads磷酸化/活化,提示雷公藤甲素是通过抑制Smads磷酸化而防止miR-30s的下调,从而对足细胞起保护作用。研究二:糖皮质激素通路与TGFβ-Smad2/3通路在足细胞损伤中的相互作用研究目的:已有研究表明TGF-β是介导足细胞损伤的重要通路之一,而糖皮质激素能直接作用并保护足细胞,但两者之间是否存在联系尚未阐明。本研究探讨糖皮质激素通路与TGFβ-Smad2/3信号通路在足细胞损伤中的关系。方法:糖皮质激素处理体外培养的足细胞后,提取足细胞细胞核或者细胞质以及全蛋白,用Western印记检测激素受体的表达情况。在有和无糖皮质激素存在的情况下以TGF-β处理足细胞,分别用免疫荧光和Western检测Smad2/3的核转移情况及磷酸化水平。siRNA敲低激素受体后检测其对pSmad2/3的抑制作用;用Co-IP检测Smad2/3和激素受体蛋白是否直接结合。结果:1)糖皮质激素受体GR 在无GC情况下均大量存在于足细胞核内;2)TGF-β刺激足细胞后引起Smad2/3的磷酸化和入核,并与核内预先存在核内的糖皮质激素受体GR结合;3)在GC存在下,GR大量降解,pSmad2/3大量脱磷;4)GC不影响TGF-β诱导的Smad2/3的磷酸化和入核。结论:糖皮质激素受体以不依赖GC的方式存在与足细胞核并可能发挥某些生物学作用;TGF-β诱导Smad2/3的磷酸化和入核,并与核内GR结合并可能因此免于磷酸酶脱磷,从而促进有害基因的转录;GC存在下,GC可直接入核使GR和pSmad3分离,导致GR降解和pSmad3的脱磷和失活,从而保护足细胞。