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阿特拉津(2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪)是一种广泛使用的三嗪类除草剂,主要用于玉米、高粱和甘蔗等选择性防除一年生双子叶杂草。阿特拉津通过抑制植物的光合作用达到除草的目的,其作用方式是抑制光合系统Ⅱ中的电子传递。大豆是对阿特拉津非常敏感的作物,土壤中阿特拉津对大豆的安全浓度是0.7911mg.kg-1,高于此浓度将会对大豆产生药害。2010年本研究室筛选出一株能够诱导大豆抗阿特拉津的细菌菌株Klebiella penumoniae,通过田间和温室盆栽试验证明该菌株发酵液处理大豆种子,可以诱导大豆产生对阿特拉津抗性,且该菌经过高压灭菌处理后仍然具有诱导效果。本文针对菌株SnebYK的诱导效果,研究了菌株SnebYK和灭活处理的SnebYK(以下简写为P-SnebYK)诱导大豆抗阿特拉津的生理生化机制,通过蛋白质组学探讨了SnebYK处理后大豆叶片的蛋白变化,利用实时荧光定量PCR检测了阿特拉津代谢途径中相关酶基因的表达量,以期从生理生化和分子角度揭示SnebYK诱导机制,主要研究内容如下：1. SnebYK安全性测试：SnebYK和P-SnebYK能够抑制小麦种子的萌发率；对大豆品种九三-03-42种子的萌发及胚芽和胚根的生长具有促进作用；对水稻种子和花生种子的萌发没有显著影响。对种子处理后各作物后期长势的观察,SnebYKP-SnebYK对小麦、水稻和大豆的生长具有一定的促进作用。2.选用50个不同地区的大豆品种进行验证,进一步确定细菌SnebYK的诱导效果。结果表明：经过细菌SnebYK和P-SnebYK发酵液诱导处理的大豆能在阿特拉津有效成分大于500g/hm2的土壤条件下正常生长,地上部干物质积累量增加,株高、根长、地上部鲜重和地下部鲜重均未受到阿特拉津的药害影响,冠部和根部的药害反应均在80%以上；成熟期的株高、豆荚数、和百粒重均未受到阿特拉津的影响,经过SnebYK和P-SnebYK发酵液的处理,大豆能在阿特拉津的环境下正常生长,能够开花结实。说明细菌SnebYK和P-SnebYK能有效的增加大豆对阿特拉津的耐性,且诱导效果没有种质差异,这为大豆和与玉米的轮作以及大豆田施用阿特拉津提供可能性。3.通过测定SnebYK和P-SnebYK包衣处理,以及包衣处理后喷施阿特拉津大豆植株的光合参数和生理生化变化,初步探索SnebYK 和 P-SnebYK诱导大豆抗阿特拉津的生化机制。结果证明：成株期叶面喷施SnebYK 和 P-SnebYK能够缓解阿特拉津对大豆植株的净C02同化效率、气孔导度和胞间C02浓度的限制,缓解阿特拉津对大豆光合作用的抑制。未经过处理的大豆植株喷施阿特拉津后其光合作用受到抑制,在喷施后48h趋近于死亡。SnebYK和P-SnebYK能够缓解阿特拉津对大豆植株叶绿素的破坏和根系活力的抑制,诱导大豆体内谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性上升,推测GST与GR活性上升与大豆的抗性增加相关；但对谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性没有显著影响；喷施阿特拉津后,五种酶的活性显著上升。4.首次采用蛋白质组学分析方法对SnebYK和P-SnebYK诱导大豆抗阿特拉津的差异蛋白质组进行研究。通过双向凝胶电泳技术获得了空白对照、SnebYK f(?)P-SnebYK处理后大豆叶片的蛋白质2-DE图谱。对蛋白丰度变化在3倍以上、重复性好的差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定分析,其中SnebYK处理的样品中成功鉴定了10个蛋白点,P-SnebYK处理的样品中成功鉴定33个蛋白点。在这些鉴定的蛋白点中,以对照为参考胶,在SnebYK处理中有2个蛋白点上调表达,1个蛋白点下调表达,7个蛋白点特异表达。P-SnebYK处理的大豆叶片有14个蛋白点上调表达,5个蛋白点下调表达,14个蛋白点特异表达。这些特异表达的蛋白涉及植物的光合作用、能量代谢、信号转导、转录调控、细胞解毒和抗氧化等方面。5.以actin基因作为内参照基因,采用实时荧光定量PCR技术,对SnebYK和P-SnebYK处理及处理后喷施阿特拉津,大豆叶片光合作用相关蛋白RuBisCO (1,5(?)磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶)、抗氧化相关蛋白Lyc(番茄红素环化酶)、2-Cys Prx (半胱氨酸过氧化物还原酶)、acetyl-CoA oxidase (酰基辅酶A过氧化物酶体)和能量代谢相关蛋白GGH (γ-谷氨酰水解酶)基因及解毒相关基因P450、GST、GR、GPX和MRPs的表达量进行检测。结果表明,SnebYK和P-SnebYK在大豆植株0-30天的生长周期中,能够诱导RuBisCO、Lyc、2-Cys Prx、acetyl-CoA oxidase和GGH基因不同程度的上调表达；SnebYK 和 P-SnebYK能够诱导GST和GR基因的上调表达,这与大豆对阿特拉津抗性的提高正相关。处理后喷施阿特拉津,P450、GST、GR、GPX和MRPs基因表达量均上调表达。6.通过对SnebYK发酵液不同组分的初步分离,测定不同组分诱导大豆抗阿特拉津的效果,结果表明硫酸铵沉淀粗提物具有一定的诱导效果,初步将有效活性成分锁定在硫酸铵沉淀物,为有效活性物质的进一步分离纯化奠定了基础。