研究背景:舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)(Tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,多发生于舌缘,因舌体具有丰富的淋巴、血液循环且舌的机械运动频繁,舌鳞癌往往快速生长,呈现出浸润性强、恶性程度高、颈淋巴结早期转移的特点。尽管采用手术、放疗及化疗的综合治疗,舌鳞癌患者的五年生存率仍未有显著改善,且化疗极易产生耐药,最终导致肿瘤复发。白花丹素是植物白花丹的根茎提取物,具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌等作用,而白花丹素对舌鳞癌的具体作用及机制尚不明确。细胞培养稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)技术具有高效标记、定量精确等优点,是定量蛋白质组学的金标准,能够系统揭示某一药物作用于肿瘤细胞后细胞内全组蛋白的表达改变以及相关信号通路的调控变化。研究目的:本研究旨在通过SILAC定量蛋白质组学技术揭示白花丹素杀伤舌鳞癌细胞的作用及其相关分子机制,并进一步探讨白花丹素对舌鳞癌基础化疗药物顺铂的增敏作用及机制。材料和方法:1.人舌鳞癌SCC25和CAL27细胞以及正常人牙龈成纤维细胞HGF-1。2.MTT法检测白花丹素对SCC25、CAL27、HGF-1细胞的杀伤抑制作用及半数抑制浓度IC50。3.MTT法检测白花丹素对化疗药物顺铂的增敏作用。4.SILAC定量蛋白质组学检测白花丹素作用于舌鳞癌细胞后细胞内全组蛋白的表达改变以及相关信号通路的调控变化。5.集落形成实验检测白花丹素和/或顺铂作用于舌鳞癌细胞后细胞集落的形成情况。6.PI流式细胞法检测白花丹素和/或顺铂作用于舌鳞癌细胞后细胞周期的分布情况。7.Annexin V:PE流式细胞法检测白花丹素和/或顺铂作用于舌鳞癌细胞后细胞凋亡的诱导情况。8.Cyto ID流式细胞法检测白花丹素和/或顺铂作用于舌鳞癌细胞后细胞自噬的诱导情况。9.共聚焦荧光显微镜检测白花丹素作用于舌鳞癌细胞后细胞自噬的诱导情况。10.CM-H2DCFDA法检测白花丹素作用于舌鳞癌细胞后细胞内活性氧水平。11.Western blotting法检测白花丹素作用于舌鳞癌细胞后上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性蛋白的表达情况。12.Western blotting法检测白花丹素和/或顺铂作用于舌鳞癌细胞后信号通路蛋白的表达情况。结果:1.白花丹素作用后舌鳞癌细胞内全组蛋白及信号通路的改变:(1)白花丹素作用12、24、48和72 hr后,舌鳞癌SCC25细胞的IC50分别为14.8、8.4、7.4、4.3μM;CAL27细胞的IC50分别为8.7、3.1、2.2、1.2μM;正常牙龈成纤维细胞HGF-1的IC50分别为35.7、29.9、17.4、8.1μM。(2)SILAC定量蛋白质组学结果发现白花丹素能够引起SCC25细胞中398种蛋白分子、101条信号通路的改变及CAL27细胞中354种蛋白分子、100条信号通路的改变。2.白花丹素诱导舌鳞癌细胞周期阻滞、凋亡与自噬的作用及机制:(1)白花丹素以浓度/时间依赖的方式抑制SCC25、CAL27细胞集落形成。(2)白花丹素以浓度/时间依赖的方式诱导SCC25和CAL27细胞G2/M期阻滞。细胞周期蛋白cdc2、cyclin B1、Cdc25C的表达水平下降,而p53、p27和p21的表达水平升高。(3)白花丹素以浓度/时间依赖的方式诱导SCC25和CAL27细胞凋亡。细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达水平下降,而Bax、PUMA、Cytochrome C、FADD、TRADD、DR5、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平升高。(4)白花丹素以浓度/时间依赖的方式诱导SCC25和CAL27细胞自噬。细胞自噬蛋白Beclin 1表达水平升高,且LC3-II/LC3-I的比值上升。(5)较白花丹素单独作用组,白花丹素分别联合SB202190、Doxorubicin作用时,舌鳞癌细胞凋亡与自噬水平升高;白花丹素分别联合Chloroquine、Z-VAD(OMe)-FMK作用时,舌鳞癌细胞凋亡与自噬水平下降;白花丹素分别联合EGFR、Anisomysin、PA作用时,舌鳞癌细胞凋亡与自噬水平下降。(6)白花丹素作用后,舌鳞癌SCC25、CAL27细胞中的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均有不同程度的下降。3.白花丹素抑制舌鳞癌细胞上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性的作用及机制:(1)白花丹素能够显著诱导舌鳞癌SCC25、CAL27细胞活性氧生成且该作用可被活性氧清除剂NAC、GSH阻断。(2)白花丹素作用后,舌鳞癌SCC25、CAL27细胞中p-p38 MAPK/p38MAPK、n-Nrf2/c-Nrf2的比值及抗氧化反应元件NQO1、GST、HSP90蛋白的表达均下降。(3)白花丹素能够抑制舌鳞癌细胞上皮间质转化,在SCC25、CAL27细胞中,与空白对照相较,E-cadherin/N-cadherin的比值均升高。(4)白花丹素作用后,舌鳞癌SCC25、CAL27细胞中的肿瘤干细胞样特性蛋白Oct-4、Bmi-1、Nanog、Sox-2的表达水平下降。(5)当白花丹素联合NAC、GSH作用时,较白花丹素单独作用组,舌鳞癌SCC25、CAL27细胞的G2/M期、凋亡、自噬百分比均下降,而EMT及肿瘤干细胞样特性蛋白的表达水平升高。4.白花丹素对舌鳞癌细胞顺铂化疗增敏的作用及机制:(1)在SCC25细胞中,当顺铂单独作用时,其IC50为2.937μM,当顺铂联合5μM白花丹素作用时,IC50为0.634μM;在CAL27细胞中,当顺铂单独作用时,其IC50为23.33μM,当顺铂联合1μM白花丹素作用时,IC50为10.31μM。(2)当顺铂联合白花丹素作用时,较顺铂单独作用组,SCC25、CAL27细胞中的集落形成率均有不同程度的下降。(3)当顺铂联合白花丹素作用时,较顺铂单独作用组,SCC25、CAL27细胞G2/M期细胞百分比均有不同程度的升高。(4)当顺铂联合白花丹素作用时,较顺铂单独作用组,SCC25、CAL27细胞凋亡百分比均有不同程度的升高。(5)当顺铂联合白花丹素作用时,较顺铂单独作用组,SCC25、CAL27细胞自噬百分比均有不同程度的升高。(6)白当顺铂联合白花丹素作用时,较顺铂单独作用组,SCC25、CAL27细胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK、n-Nrf2/c-Nrf2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR的比值均有不同水平的下降。结论:1.白花丹素能够有效抑制舌鳞癌细胞的增殖活性,而不影响正常牙龈成纤维细胞的增殖;白花丹素能够广泛调控舌鳞癌细胞的细胞周期、凋亡、自噬、上皮间质转化及氧化还原状态。2.白花丹素能够以浓度/时间依赖的方式抑制舌鳞癌细胞集落形成并且诱导细胞G2/M期阻滞;白花丹素通过抑制PI3K/Akt/m TOR及p38 MAPK信号通路诱导舌鳞癌细胞凋亡与自噬;白花丹素诱导的舌鳞癌细胞凋亡与自噬之间存在相互促进作用。3.白花丹素通过抑制p38 MAPK/Nrf2信号通路诱导舌鳞癌细胞产生大量活性氧;白花丹素能够显著抑制舌鳞癌细胞上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性;白花丹素诱导的活性氧参与调控舌鳞癌细胞的G2/M期阻滞、凋亡与自噬诱导及上皮间质转化、肿瘤干细胞样特性抑制。4.白花丹素通过抑制PI3K/Akt/m TOR和p38 MAPK/Nrf2信号通路诱导舌鳞癌细胞G2/M期阻滞、凋亡与自噬进而增强舌鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性。