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研究目的利用肺炎衣原(Chlamydia pneumoniae, C.pn)体外感染大鼠原代血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)模型,观察基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)在C.pn感染诱导VSMC迁移过程中的作用；观察黄连素对C.pn感染诱导VSMC迁移的干预作用,并探讨其相关的分子机制。内容和方法1.C.pn增殖培养后体外感染大鼠原代VSMC;2. MMPs广谱抑制剂GM6001抑制MMPs后,Wound-healing实验和侵袭实验观察MMPs在C.pn感染诱导VSMC迁移中的作用；3.逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测C.pn感染后VSMC内MMPs mRNA的表达水平；4.明胶酶谱法检测C.pn感染VSMC后MMP9酶活性的变化；5.酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测C.pn感染VSMC后MMP3和MMP9蛋白的表达水平；6.PI3K特异性抑制剂LY294002抑制PI3K的活性后,明胶酶谱法和ELISA分别检测各组VSMC MMP9酶活性及MMP3和MMP9蛋白表达水平的变化；7.利用CCK-8实验观察黄连素对VSMC活力的影响；8.不同浓度黄连素干预C.pn感染的VSMC后,Wound-healing和侵袭实验观察黄连素对C.pn感染诱导的VSMC迁移能力的影响；运用明胶酶谱法和ELISA分别检测各组VSMC MMP9酶活性水平及MMP3和MMP9蛋白表达水平的变化；9.黄连素干预C.pn感染的VSMC后,Western blot实验检测C.pn感染后VSMC Akt磷酸化水平的变化。结果1. Wound-healing实验结果显示,C.pn感染VSMC24h后,感染组细胞向划痕中央迁移的面积明显大于正常对照组(P<0.05)；GM6001预处理VSMC后C.pn感染诱导的VSMC向划痕中央迁移的面积明显低于单纯C.pn感染组(P<0.05)。侵袭实验结果显示,C.pn感染VSMC24h后穿越Matrigel胶的细胞数明显高于正常对照组(P<0.05)；GM6001预处理后C.pn感染的VSMC穿越Matrigel胶的数目明显低于单纯C.pn感染组(P<0.05)。2. RT-PCR结果显示,MMP1和MMP2mRNA的表达水平在C.pn感染VSMC后的各个时间点均无明显变化(P>0.05)；而MMP3mRNA的表达水平则从C.pn感染后4h开始升高,18h达到峰值,并持续至72h (P<0.05); MMP9mRNA的表达水平从感染后18h开始升高,36h达到峰值,持续至72h(P<0.05)。3.明胶酶谱实验结果显示,MMP9酶活性在C.pn感染后6h开始升高,并随着感染时间的延长其活性逐渐增高,至72h达到最高；且在所观察的时间段内,MMP9的酶活性与C.pn感染VSMC的时间呈正相关(相关系数r=0.9829,P<0.05)。用LY294002抑制PI3K活性后,C.pn感染的VSMC MMP9的酶活性较单纯C.pn感染组明显降低(P<0.05)。4. ELISA结果显示,MMP3的蛋白表达在C.pn感染后12h开始升高,24h升高最明显(P<0.05),并持续至72h。MMP9的蛋白表达在C.pn感染后24h开始升高,至72h达到最高(P<0.05)。用LY294002抑制PI3K活性后,在C.pn感染的VSMC内MMP3和MMP9的蛋白表达明显低于单纯C.pn感染组(P<0.05)。5.CCK-8实验结果显示,黄连素浓度在低于100μM时,VSMC的活力和正常对照组相比无明显变化,差异无统计学意义；而黄连素浓度高于100μM时,VSMC的活力较正常对照组明显减弱(P<0.05),且浓度越高,细胞活力减弱越明显,即150μM时VSMC的活力下降到正常VSMC活力的63%；200μM和300μM时,VSMC的活力分别下降到正常VSMC活力的47%和19%6. Wound-healing实验结果显示,不同浓度黄连素干预C.pn感染的VSMC后,各组细胞向划痕中央迁移的面积较单纯C.pn感染组均明显减小(P<0.05),且细胞迁移的面积随黄连素浓度的升高而逐渐减小。侵袭实验结果显示,C.pn感染VSMC后,黄连素各组穿Matrigel的VSMC数较单纯C.pn感染组均降低(P<0.05)；且随着黄连素浓度增加穿膜细胞数逐渐减少。7.明胶酶谱实验结果显示,与正常对照组相比,C.pn感染VSMC36h后,MMP9的酶活性明显升高(P<0.05)；与单纯C.pn感染组相比,经黄连素干预的C.pn感染的VSMC MMP9的活性明显减弱(P<0.05)；且黄连素的浓度越高,MMP9的酶活性减弱越明显。ELISA结果也显示,黄连素干预的C.pn感染的VSMC MMP3和MMP9的表达水平较单纯C.pn感染组均明显下降(P<0.05)；且黄连素的浓度越高,MMP3和MMP9的表达水平越低。8. Western blot实验结果显示,各组VSMC中总Akt和β-actin的表达水平无明显变化,差异无统计学意义。C.pn感染组VSMC p-Akt的表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05)；黄连素(50μM)干预的C.pn感染的VSMC p-Akt表达水平显著低于单纯C.pn感染组(P<0.05)。结论C.pn感染可能经由PI3K通过调控MMP3和MMP9的酶活性和表达水平促进VSMC迁移；而黄连素可能通过负调控PI3K/Akt相关的MMP3和MMP9的酶活性和表达水平拮抗C.pn感染诱导的VSMC迁移。