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布罗佐喷钠[Sodium(±)-5-Bromo-2-(α-hydroxypentyl)benzoate,5-溴-2-(α-羟基戊基)]苯甲酸钠,商品名:Brozopine,BZP)是由郑州大学化学系在天然化合物芹黄素的基础上经过结构修饰、构效关系评价等遴选出来的,具有自主知识产权的新型化合物,目前已进入临床Ⅱ期阶段。本课题选用PC12细胞构建体外缺氧缺糖/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation and reintroduction,OGD/R)模型,探究BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制。第Ⅰ部分BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用目的:建立PC12细胞OGD/R模型,探讨BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:1 OGD/R损伤模型的建立采用含Na2S2O4的低糖培养基造成PC12细胞缺氧缺糖,然后换正常培养基复氧复糖,以细胞形态变化和细胞存活率(CCK8法)作为评价指标,筛选出细胞存活率为50%左右时含Na2S2O4的低糖培养基的作用时间以及Na2S2O4的作用浓度,建立稳定的PC12细胞OGD/R损伤模型。2 BZP给药浓度的确定不同治疗浓度的BZP分别作用于PC12细胞OGD/R损伤模型,制作BZP的量效曲线,确定BZP给药的低、中、高浓度。3分组与给药PC12细胞(1×105/ml)接种于96孔板中。分为7组:Control组;OGD/R损伤组;阳性对照药:丁基苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)、6-溴基丁基苯酞(3-butyl-6-bromo-1(3H)-isobenzofuranone,Br-NBP)组;BZP低、中、高浓度组。NBP、Br-NBP、BZP低、中、高浓度组为均需加入对应浓度的NBP、Br-NBP、BZP预处理24小时后,再进行OGD/R损伤处理。4观察指标镜下观察BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤后的细胞形态学改变;采用CCK8法检测细胞存活率;生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的含量;吖啶橙(AO)染色法检测细胞凋亡形态;碘化丙啶(PI)染色法、Annexin V/PI试剂盒检测细胞凋亡率。结果:1 OGD/R损伤模型的建立根据细胞存活率的变化,选用终浓度10 mmol/L Na2S2O4低糖培养基造成PC12细胞缺糖缺氧,3 h后,更换为正常培养基复糖复氧,在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h,然后进行各指标的观察。2 BZP给药浓度的确定根据BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用的量效曲线,确定BZP的给药浓度分别为2、10、50μmol/L。3细胞存活率的变化BZP 2、10、50μmol/L组细胞存活率分别是59.3±4.97%,68.6±1.75%,84.6±2.78%,较OGD/R损伤组明显升高(53.3±2.87%;P<0.01,P<0.05),并呈现浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L提高细胞存活率的效果优于等摩尔浓度的NBP、Br-NBP(P<0.05)。结果显示,BZP可抑制PC12细胞的OGD/R损伤,能显著提高细胞的存活率。4 LDH漏出量变化与OGD/R损伤组相比,BZP 2、10、50μmol/L组细胞LDH漏出量分别为672±11.4,644±13.4,553±46.7 U/L,LDH漏出量的抑制率分别为26.7%,29.8%,39.7%,较OGD/R损伤组明显减少(917±94.8 U/L;P<0.01),并呈现浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L抑制LDH漏出的效果优于等摩尔浓度的NBP(771±10.8 U/L,P<0.05)。结果显示,BZP可减少PC12细胞的OGD/R损伤的LDH漏出量。5凋亡形态变化OGD/R损伤组出现典型的凋亡细胞特征:细胞及细胞核皱缩,染色质凝聚成团状,细胞核碎裂,出现凋亡小体等。BZP 2、10、50μmol/L组显著改善细胞形态。结果显示BZP可改善OGD/R诱导的PC12细胞损伤后的细胞凋亡形态。6凋亡率变化PI染色结果显示,BZP 2、10、50μmol/L组阳性细胞率分别为60.3±12.7,49.3±7.98,29.3±11.5,较OGD/R损伤组明显降低(80.7±14.6;P<0.05,P<0.01),并呈现浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度NBP相比,BZP强于NBP(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,BZP 2、10、50μmol/L组的细胞凋亡率分别为7.34±0.16%,5.41±0.17%,3.11±0.24%,较OGD/R损伤组明显降低(9.42±0.347%;P<0.05,P<0.01)。其中BZP 10μmol/L抑制细胞凋亡的效果优于等摩尔浓度的NBP(P<0.05)。综上,BZP可降低OGD/R诱导的PC12细胞损伤后的细胞凋亡率,抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。结论:BZP对OGD/R诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。第Ⅱ部分布罗佐喷钠对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用机制目的:探究布罗佐喷钠(Brozopine,BZP)对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用机制,从而为临床应用提供相关依据。方法:1 OGD/R损伤模型的建立同第Ⅰ部分2分组与给药同第Ⅰ部分3观察指标:生化试剂盒检测丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的含量和活性;罗丹明123(Rh123)染色法检测线粒体膜电位(MMP);2’,7’-二氯二氢荧光素(DCFHDA)染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Fura 2-AM负载法检测胞浆内游离钙浓度([Ca2+]i);Western Blot检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的表达水平。结果:1抑制细胞脂质过氧化1.1 MDA含量变化BZP 2、10、50μmol/L组MDA的含量分别为4.07±0.585,3.73±0.176,3.12±0.237μmol/μg prot,较OGD/R损伤组明显减少(4.82±0.347;P<0.05,P<0.01)。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度的NBP、Br-NBP相比均无显著性差异(P>0.05)。结果显示,BZP可减少OGD/R诱导的PC12细胞损伤后的MDA含量。1.2 NO生成变化BZP 2、10、50μmol/L组NO的生成分别为0.776±0.104,0.607±0.128,0.306±0.189μmol/L,较OGD/R损伤组明显减少(1.66±0.299;P<0.01)。其中BZP 10μmol/L抑制NO的生成效果优于等摩尔浓度的NBP(P<0.05)。结果显示,BZP可降低OGD/R诱导的PC12细胞损伤后的NO的生成。1.3 GSH-px活性变化BZP 2、10、50μmol/L组对GSH-px的活性分别为17.5±3.15,13.9±1.94,11.0±1.52 U/μg prot,较OGD/R损伤组无明显变化(11.98±7.42);而NBP 10μmol/L组可显著升高GSH-px的活性(30.7±1.45 U/μg prot,P<0.05)。2 MMP变化BZP 2、10、50μmol/L组的阳性细胞率分别为29.2±1.59%,36.5±1.76%,46.6±2.37%,较OGD/R损伤组明显升高(28.5±3.47%;P<0.05)。BZP 10μmol/L与等摩尔浓度的NBP、Br-NBP相比,效果优于NBP、Br-NBP(P<0.05)。结果显示,BZP可显著升高OGD/R诱导的PC12细胞损伤后细胞的MMP。3 ROS变化BZP 2、10、50μmol/L组的阳性细胞率分别为37.6±1.59%,33.7±1.76%,20.8±2.37%,较OGD/R损伤组明显降低(57.8±1.57%;P<0.01),并呈浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度的NBP相比,BZP强于NBP(P<0.05)。结果显示,BZP可降低OGD/R诱导的PC12细胞损伤后细胞内ROS的水平。4[Ca2+]i变化在含钙的Krebs液中,BZP 2、10、50μmol/L组的阳性细胞率分别为31.6±1.26%,27.0±3.23%,22.4±2.55%,较OGD/R损伤组明显降低(43.3±3.98%,P<0.01)。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度的NBP、Br-NBP相比均无显著性差异(P>0.05)。在无钙的Krebs液中,BZP 2、10、50μmol/L组荧光强度无显著性改变。结果显示,BZP是通过抑制细胞外钙离子内流,而不是通过抑制肌浆网内钙释放来降低[Ca2+]i。5 Bax/Bcl-2,cleaved caspase-3/caspase-3蛋白表达水平的变化BZP 2、10、50μmol/L组Bax/Bcl-2分别为1.74±0.31,1.60±0.26,1.41±0.10,较OGD/R损伤组明显降低(1.74±0.31;P<0.01),并呈现浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度NBP、Br-NBP相比,BZP优于NBP、Br-NBP(P<0.05)。BZP2、10、50μmol/L组cleaved caspase-3/caspase-3分别为1.45±0.32,1.25±0.27,1.05±0.17,较OGD/R损伤组明显降低(1.74±0.31;P<0.01),并呈现浓度依赖性。其中BZP 10μmol/L与等摩尔浓度NBP、Br-NBP相比,BZP优于NBP(P<0.05)。结果显示,BZP可通过降低Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3/caspase-3抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。结论:1 BZP对OGD/R诱导的PC12细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抗脂质过氧化、减少ROS积聚、升高MMP、降低[Ca2+]i。2 BZP抑制cleaved-Caspase-3、Bax的表达,降低cleaved caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2的比值,说明BZP有抗凋亡作用。