脑白质损伤(white matter injury,WMI)是新生儿脑损伤中的一种常见病变,存活的早产儿中WMI的发生率为5-10%,而在极低体重早产儿(<1500g)中,WMI发生率可高达50%。WMI诊断主要根据患儿的神经系统症状和体征以及部分患者磁共振检查(MRI)提示脑白质信号异常。据WHO统计,随着早产儿数量的增加,WMI的发病率也逐年增加。WMI患儿在成长过程中会出现神经功能发育异常,如运动障碍、感觉异常、认知功能下降等,部分严重患者的神经功能障碍会持续至成年甚至终身,这给患者和社会带来严重的心理和经济负担。WMI的致病机制尚不清楚,目前认为多种因素如缺氧、脑出血、脑外伤等均可诱发新生儿白质损伤的发生。尽管使用硫酸镁预处理待产产妇可能缓解早产儿的神经功能障碍,但由于对WMI的发病机制认识有限,临床上尚无治疗WMI的有效措施和药物。脑白质的主要成分为髓鞘化的神经纤维。髓鞘是脊椎动物中枢神经系统一种重要结构,由少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)的膜状突起反复包绕神经元轴突形成。髓鞘绝缘轴突,呈节段性分布,相邻髓鞘间小段裸露的轴突膜上富含钠离子通道,可产生动作电位,被称为郎飞结(Node of Ranvier)。髓鞘的形成使动作电位在相邻的郎飞结间快速、高效传导。最近的研究还发现,OL可通过髓鞘上单羧酸转运体1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)向轴突转运乳酸作为轴突的能量物质。人类髓鞘的发育从胚胎期开始,出生后至青春期达到高峰,并可持续到老年。形成髓鞘的OLs是由少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分化和发育而来,而OPCs均匀分布于CNS并终身维持相对恒定的细胞密度。WMI病变区域可见髓鞘形成明显减少,此外还存在神经炎症、胶质细胞激活、神经元凋亡等多种病理改变,以上病理改变在WMI发生中的作用并不清楚。在WMI患者病理标本中,CC1阳性的OLs数量明显减少,但Olig2阳性的少突胶质谱系细胞总量(OLs加OPCs的数量)轻微增加,提示病变区域存在OPCs分化成熟障碍。但OPCs分化障碍所致的髓鞘形成减少在WMI发生过程中是否为导致神经功能损伤的主要因素?如果髓鞘形成减少是WMI中远期神经功能损伤的主要因素,那么其通过何种机制影响神经功能?促进髓鞘形成是否可以作为治疗WMI的策略之一?本课题围绕以上问题,从以下四个方面开展研究。(1)建立模拟WMI的新生小鼠缺氧模型,观察慢性缺氧对小鼠髓鞘形成和远期神经功能发育的影响。(2)采用少突胶质细胞特异性敲除Olig2小鼠模型(CNP-Cre;Olig2 fl/fl)模拟髓鞘发育障碍,探究髓鞘发育异常对神经功能发育的影响及可能的机制;(3)采用毒蕈碱1型受体(muscarinic receptor 1,M1R,一种负性调控OPCs分化的受体)基因条件敲除小鼠(NG2-CreErt;M1R fl/fl)建立缺氧模型,观察促进髓鞘形成是否能改善WMI导致的神经功能障碍,并进一步验证髓鞘形成调节神经功能发生的可能机制。(4)使用促髓鞘形成药物治疗慢性缺氧小鼠,观察促进髓鞘形成对WMI模型小鼠的治疗效果。我们综合采用免疫荧光染色和透射电镜等方法研究髓鞘发育和相关的组织学变化,结合神经功能行为学检测和电生理记录等方法探讨髓鞘形成对神经功能的影响及可能的机制。主要结果如下:1.慢性缺氧导致小鼠髓鞘形成减少和突触发育异常并引起远期神经功能障碍。新生小鼠从P3至P10暴露在10%氧浓度环境中,建立慢性缺氧模型。采用免疫荧光染色和透射电镜我们发现慢性缺氧小鼠存在OPCs分化障碍和髓鞘发育异常,但未见神经元调亡和轴突变性。免疫荧光染色和电生理记录结果显示慢性缺氧小鼠存在突触特异性蛋白(突触素等)表达量下调和神经传导功能下降,提示慢性缺氧小鼠中存在突触发育异常。甚至在生后40天,慢性缺氧小鼠的髓鞘和突触发育仍未恢复到正常水平。平衡杆实验提示缺氧小鼠存在运动协调功能障碍,提示该模型能有效模拟WMI患儿的远期神经功能障碍。以上结果表明慢性缺氧模型可用于WMI发病机制和治疗的研究。2.髓鞘形成减少抑制小鼠突触发育并导致远期神经功能损伤。利用CNP-Cre小鼠及Olig2 fl/fl小鼠杂交获得可在少突谱系细胞中特异性敲除转录因子Olig2的基因敲除小鼠模型。免疫荧光染色和电镜结果均提示Olig2敲除小鼠存在持续的髓鞘发育异常,与慢性缺氧小鼠的髓鞘病变一致,提示Olig2基因敲除小鼠模型有助于理解髓鞘形成在WMI中突触发育和神经功能发生中的作用。免疫细胞化学染色发现Olig2敲除小鼠中突触形成减少,电生理结果表明Olig2敲除小鼠的突触传导功能受到抑制,主要表现为兴奋性突触后电位频率降低,行为学实验提示Olig2敲除小鼠存在运动协调功能障碍。由于Olig2敲除小鼠中髓鞘形成减少仅仅与基因特异性敲除有关,而不影响神经元等细胞,表明髓鞘形成减少可直接抑制突触发育并损伤远期神经功能。3.促进髓鞘形成可改善慢性缺氧小鼠的突触发育异常和远期神经功能障碍。繁育NG2-CreERT;M1R fl/fl小鼠,在该品系小鼠慢性缺氧过程中使用他莫昔芬诱导特异性敲除OPCs中的M1受体。免疫荧光染色及电镜结果提示特异性敲除M1受体可以促进慢性缺氧小鼠的OPCs分化并增加髓鞘形成。与髓鞘改变一致的是,免疫荧光染色提示突触特异性蛋白表达增加,电生理记录表明M1R敲除小鼠的神经传导功能得到改善,以上提示促进髓鞘形成可在形态和功能上改善缺氧小鼠的突触发育。平衡杆实验结果提示M1R敲除小鼠的运动协调功能也得到了一定程度的改善。以上结果提示:使用基因操控的方式促进髓鞘形成可以改善慢性缺氧引起的小鼠突触发育异常和远期神经功能障碍。4.促髓鞘形成药物可增加缺氧小鼠的髓鞘形成,并改善突触发育和远期神经功能。氯马斯汀和(±)U-50488是两种可促进OPCs分化和髓鞘再生的化合物,在缺氧过程中,我们使用氯马斯汀和(±)U-50488处理小鼠。免疫荧光染色结果显示经药物处理后小鼠髓鞘蛋白表达和突触标志物蛋白水平,均有明显提高。同时,药物处理也可明显缓解慢性缺氧小鼠的运动和认知功能障碍。更令人振奋的是,在缺氧模型建立后,即白质损伤已经发生后,药物处理仍能促进缺氧小鼠的髓鞘形成并改善运动协调功能。以上表明促髓鞘形成化合物有望用于WMI的治疗,其可通过促进髓鞘形成缓解远期神经功能障碍。综上述,本课题首先验证了慢性缺氧模型可较好模拟WMI中的白质损伤和远期神经功能障碍,通过使用Olig2敲除小鼠模型证实早期发育过程中,髓鞘形成减少可导致突触发育异常,这二者可能共同作用导致了小鼠的远期神经功能障碍。特异性敲除M1受体或促髓鞘形成药物处理可有效改善慢性缺氧小鼠的突触发育和神经功能障碍,提示促进髓鞘形成是改善WMI远期神经功能障碍的有效策略。以上研究提出并证实了髓鞘对突触发育的调节作用,同时为WMI的促髓鞘形成治疗新策略提供了理论基础和实验依据。