论文部分内容阅读
背景：肥胖和其相关疾病已经全球流行，探讨肥胖发生的机制及治疗的新方法一直是医学领域研究热点。黑色素浓集激素（Melanin Concentrating Hormone，MCH）由下丘脑分泌，存在于血液中，是目前唯一一种减少其分泌可以导致动物体重减轻的多肽，在中枢能量调节中有着重要的作用，外周脂肪组织也可能发挥作用。啮齿类动物MCH通过其受体黑色素浓集激素受体1（MelaninConcentration Hormone Receptor1，MCHR1）起作用，沉默MCHR1，阻断MCH通路对于减少脂肪组织的生成可能有重要意义。RNA干扰（RNA influence，RNAi）成本低廉，效果可靠，可用于阻断特异目的基因的表达。本课题将利用RNAi技术沉默小鼠3T3-L1细胞MCHR1，观察对细胞脂肪合成的影响并探讨其机制，为肥胖的基因治疗奠定基础。目的：采用RNAi技术沉默MCHR1基因的表达，在观察对小鼠3T3-L1细胞脂肪合成影响的基础上，进一步探讨分子机制，为肥胖的基因治疗提供新思路。方法：（1）建立小鼠3T3-L1细胞培养及诱导分化的方法；（2）采用基因克隆技术构建3种sh-MCHR1阳性干扰载体和1种阴性载体；（3）脂质体法质粒转染小鼠3T3-L1细胞；（4）采用RT-PCR、Western blot筛选出沉默MCHR1效果最好的载体，将沉默效果最好载体转染小鼠3T3-L1细胞，MCH干预并诱导分化，油红O染色拍照并测A510，观察对脂肪合成的影响。（5）采用RT-PCR、Westernblot检测脂肪细胞转录因子过氧化物酶体增生物激活受体（PPARγ）、CAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）和脂肪因子脂肪酸结合蛋白（aP2）mRNA及蛋白的表达，初步探讨沉默MCHR1影响小鼠3T3-L1细胞脂肪合成的作用及其机制。结果：1、小鼠3T3-L1细胞生长状态良好并能诱导其分化为成熟脂肪细胞，脂滴形成量随时间的延长逐渐增多，二者呈线性关系。2、构建3种sh-MCHR1阳性干扰载体，1种阴性干扰载体分别命名为：sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3、sh-MCHR1-0，经DNA测序完全正确。3、建立质粒转染小鼠3T3-L1细胞方法，转染效率在转染72小时后达最高，介于50%-60%之间。4、分别将4种载体转染小鼠3T3-L1细胞72小时后，RT-PCR检测MCHR1mRNA显示，sh-MCHR1-0阴性对照组与正常组相比，MCHR1相对表达量无统计学差异（P>0.05）, sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3阳性载体组MCHR1相对表达量分别为0.13±0.03、0.60±0.05、0.65±0.04，较阴性载体对照组MCHR1表达显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。Westernblot检测MCHR1蛋白显示sh-MCHR1-0阴性对照组与正常组相比，MCHR1相对表达量无统计学差异（P>0.05）, sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3阳性载体组MCHR1相对表达量分别为0.15±0.03、0.61±0.02、0.64±0.04，较阴性载体对照组MCHR1表达显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。sh-MCHR1-1为沉默小鼠3T3-L1细胞MCHR1效果最好载体。将sh-MCHR1-1转染小鼠3T3-L1细胞，1000nmol/L MCH干预并诱导分化第10、12d油红O A510分别为0.46±0.02、0.54±0.03，较对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。5、将sh-MCHR1-1转染小鼠3T3-L1细胞，1000nmol/L MCH干预并诱导分化，PPARγ mRNA第6、8、10、12d相对表达量分别为0.36±0.02、0.45±0.04、0.58±0.04、0.63±0.02较对同期照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；C/EBPα mRNA第8、10、12d相对表达量分别为0.34±0.03、0.42±0.03、0.51±0.01较同期对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；aP2mRNA第8、10、12d相对表达量分别为0.39±0.02、0.42±0.01、0.48±0.01较同期对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。Western Blot检测结果显示PPARγ蛋白第8、12d相对表达量分别为0.46±0.03、0.61±0.04较同期对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；C/EBPα蛋白第8、12d相对表达量分别为0.51±0.03、0.68±0.02较同期对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；aP2蛋白第8、12d相对表达量分别为0.54±0.01、0.68±0.02较同期对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：沉默小鼠3T3-L1细胞MCHR1能够减缓其MCH干预并诱导分化过程中脂肪的合成，机制可能为通过减弱MCH诱发的ERK1/2信号，减少PPARγ和C/EBP转录子的活化，减少aP2等脂肪因子的表达，最终导致细胞脂肪合成量减少。本研究为肥胖的基因治疗提供了新思路。