JAK激酶能够转导细胞因子和生长因子等介导的信号通路从而在细胞的增殖、分化及生长过程中起着非常重要的作用。本论文是应用药物设计学原理,以上市的JAK激酶抑制剂药物鲁索替尼(Ruxolitinib)为先导化合物,在其结构基础上进行合理的药物设计并合成了 3个系列结构新颖的JAK激酶抑制剂。然后以新设计的JAK激酶抑制剂的结构为基础,依据HDAC靶酶结构生物学研究及其抑制剂构效关系,设计并合成了 1个系列具有强效抗肿瘤活性的JAK与HDAC双靶点抑制剂。一、研究背景JAK激酶与人体很多重要的生物学功能相关。研究已证实,JAK激酶发挥不同的生物学功能是由JAK不同亚型相互配对并作用于不同的受体决定的。其中,JAK1能够与JAK2 JAK3及TYK2配对,与IFN-γ、含有γ链的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-7等及1型IFNs的受体作用,从而在炎症、抗病毒、免疫缺陷、骨质增生、白血病、多发性骨髓瘤、适应性免疫、淋巴细胞生长等诸多过程发挥着重要作用。JAK2则能与JAK1,JAK2,TYK2等配对,并作用于IL-3、IL-5、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素和促血小板生成素等受体上,从而在骨髓生成、红细胞生成、免疫细胞分化、慢性炎症等过程中发挥极为重要的作用。JAK激酶缺陷会引发很多疾病,JAK1突变经常出现在风湿性关节炎和自身免疫性疾病的患者身上,血液性疾病、骨髓增生紊乱则常常与JAK2突变相关,JAK3和TYK2缺陷经常导致病人罹患严重联合免疫缺陷疾病(SCID)及原发性免疫缺陷。迄今为止,FDA批准了两个JAK激酶抑制剂药物上市,分别为托法替尼(Tofacitinib)和鲁索替尼(Ruxolitinib)。托法替尼于2012年被批准上市用于风湿性关节炎(RA)的治疗。鲁索替尼分别于2011年和2014年依次被批准用于骨髓纤维化(MF)及真性红细胞增多症(PV)的治疗。此外,还有多个JAK抑制剂正处于临床开发阶段。因此,针对JAK激酶这一靶标进行设计的抑制剂在抗炎、抗癌及治疗血液性疾病等领域具有很大的应用前景。HDAC对肿瘤细胞的发展过程影响比较广泛,包括肿瘤细胞的血管生成、转移、分裂增殖、分化、自噬及凋亡等,抑制HDAC能够恢复正常基因的表达,从而可以达到治疗肿瘤的目的。在癌症治疗领域中,HDAC抑制剂的应用比较成熟。有研究表明,JAK抑制剂能与HDAC抑制剂联合用药用于治疗肿瘤并且产生协同作用。因此,JAK与HDAC双靶点抑制剂有望克服肿瘤耐药株的耐药性问题,从而成为新颖的骨髓增生瘤和急性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤的治疗手段。二、JAK激酶抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究对现有的JAK抑制剂的药效团和构效关系总结发现,几乎所有的强效的JAK激酶抑制剂都含有与JAK激酶的铰链区(Hinge)相匹配的结构片段。一般该结构能与JAK激酶的铰链区形成较强的氢键作用,最为常见的结构为嘧啶胺类或者吡咯并嘧啶胺类等。除了这个结合位点外,JAK激酶还拥有甲基化口袋、P-Loop等。根据JAK激酶与其抑制剂的作用模式,借助计算机辅助药物设计,结合生物电子等排体、优势结构等设计策略,我们设计了 3个系列共计60余个结构全新的JAK激酶抑制剂。所有的目标化合物都利用常用的原料进行化学合成,经过Wittig-Horner反应、Michael加成反应、胺的亲核反应、Suzuki反应、还原反应等基本反应合成最终目标产物。我们对所合成的目标化合物进行了初步的生物活性评价,包括体外JAK酶活的测定(含JAK1,JAK2,JAK3及TYK2)、MTT抗肿瘤细胞增殖实验、western-blot实验等。结果显示大部分化合物都具有明显的JAK激酶抑制活性,尤其是化合物Ⅱ-17m,Ⅲ-3f及Ⅲ-11b,这些化合物的JAK激酶抑制活性在纳摩尔水平。我们利用western-blot实验证实了化合物Ⅱ-17m在5 μM浓度条件下对HeLa细胞的JAK2的磷酸化有很强的抑制作用。此外,MTT实验证实了化合物Ⅲ-3f对不同的细胞株(PC-3,HEL,K562,MCF-7和MOLT4)均表现出微摩尔水平的抗增殖活性,化合物Ⅲ-11b对HEL及K562的抗增殖活性尤为突出,表现出亚微摩尔水平。三、JAK与HDAC双靶点抑制剂的设计、合成与抗肿瘤活性研究鉴于化合物Ⅲ-3f具有很强的抗肿瘤细胞增殖活性,我们以此化合物结构作为先导化合物,设计并合成了 20余个JAK和HDAC双靶点抑制剂,以期发现抗肿瘤活性更好的化合物。我们对所合成的目标化合物进行了初步的生物活性评价,包括体外JAK酶活的测定(含JAK1,JAK2,JAK3及TYK2)、体外HDAC酶活的测定、HDAC亚型选择性的测定(HDAC2、HDAC6和HDAC8)、MTT抗肿瘤细胞增殖实验、细胞凋亡实验、裸鼠体内抗肿瘤增殖活性实验等。实验结果发现这系列化合物对JAK激酶和HDAC的抑制活性均为纳摩尔水平。MTT实验证实我们的化合物对血液瘤HEL细胞、K562细胞、MOLT4细胞及Jurkat细胞均表现出亚微摩尔水平的抗增殖活性,其中化合物Ⅳ-10e及Ⅳ-10s的抗癌细胞的增殖活性尤为突出。在细胞凋亡实验中,我们发现化合物Ⅳ-10e及Ⅳ-10s对HEL和K562两株白血病细胞株具有很强的促凋亡活性。在裸鼠动物模型中,初步的实验结果证实,化合物Ⅳ-10e能够有效的抑制裸鼠皮下的HEL细胞的生长,且未发现明显的肝脏和脾脏毒性。经过上述实验我们证实了化合物Ⅳ-10e可以作为一个潜在的口服有效的抗肿瘤先导化合物。四、全文总结与展望本研究论文以JAK激酶为靶标,也结合了双靶标的设计思想,综合运用药物化学、计算机辅助药物设计、化学生物等前沿学科知识,设计并合成了4个系列总计80余个JAK激酶抑制剂。然后经过生物活性评价我们得到了极具开发前景的强效的JAK和HDAC双靶点抑制剂Ⅳ-10e,该化合物的出现为研究多靶点抗肿瘤的药物设计开辟了新的方向。接下来,我们可以进一步研究该化合物的药代动力学性质、急性毒性、分子水平上的抗肿瘤机制,从而全面地考察该化合物的成药性。