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从黄酒发酵液中分离的短乳杆菌2-34(Lactobacillus brevis 2-34)具有重吸收瓜氨酸的能力,由于其中瓜氨酸转运机制并不清楚,导致该菌株尚未成功应用于黄酒酿造,以达到减少瓜氨酸含量从而最终降低氨基甲酸乙酯含量的目的。本课题对该菌株中假定的瓜氨酸转运蛋白进行鉴定和功能研究,初步探索瓜氨酸转运机理,为该菌株的应用奠定理论基础。对L.brevis 2-34基因组中两个假定的瓜氨酸转运蛋白编码基因——dcuC和a/o antiporter,利用Cre-loxp系统对二者进行基因敲除,发现基因敲除菌株代谢精氨酸速度变慢,且无法将分泌至发酵液中的瓜氨酸完全重吸收回胞内。此外,ΔdcuC菌株发酵结束后发酵液中瓜氨酸的含量更高,说明DcuC和A/O antiporter蛋白均能够吸收细胞外的瓜氨酸,且DcuC吸收效率更高。以质粒pRSFDuet-1和pETDuet-1为表达载体,分别通过构建多顺反子串联表达系统以及双质粒表达系统,在Escherichia coli C43(DE3)中表达瓜氨酸代谢相关蛋白:ArcD(精氨酸/鸟氨酸转运蛋白)、ArcA(精氨酸降解酶)、ArcB(瓜氨酸降解酶)以及DcuC或A/O antiporter(假定的瓜氨酸转运蛋白)。结果显示,所有重组菌株均可利用精氨酸并分泌瓜氨酸,且与无瓜氨酸转运蛋白的对照组菌株相比,表达了DcuC或A/O antiporter的重组菌株发酵液中瓜氨酸含量更低,进一步证明了DcuC和A/O antiporter均具有吸收瓜氨酸的功能。通过RT-PCR技术监测L.brevis 2-34在含精氨酸培养基中生长时基因的转录情况,发现在对数中期及中后期,即瓜氨酸被迅速重吸收回胞内时,蛋白ArcD编码基因基本不转录,而DcuC和A/O antiporter编码基因仍有较高的转录水平,证明了DcuC和A/O antiporter与瓜氨酸吸收的相关性。通过生物学信息方法,对DcuC和A/O antiporter蛋白结构进行分析,发现二者均含有跨膜结构,为膜蛋白。核心结构域DcuC已被证明在乳酸菌中与瓜氨酸吸收相关。同时二者均含有翻译后修饰位点,可能与其转运瓜氨酸的方向转换有关。