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D-氨基酸氧化酶(D-AAOs,EC1.4.3.3)是一种黄素酶类,可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨,在体内D-氨基酸代谢中起着重要作用,并广泛存在于生物界中。从众多的研究结果看来,到目前为止对来源于原核生物的D-氨基酸氧化酶的研究进行的比较少,2006年才首次从原玻璃蝇节杆菌属Arthrobacter protophormiae中分离得到该酶的基因并对其进行了初步的研究,这是迄今为止唯一一个针对原核生物D-氨基酸氧化酶的研究报道。本研究通过从原玻璃蝇节杆菌属A. protophormiae (DSM20168)中克隆得到D-氨基酸氧化酶基因,并对其进行定点突变,最后对野生型和突变型DAAO进行了初步的酶学特性鉴定,不仅是源于原核生物D-氨基酸氧化酶研究的补充,同时为构建更多有利于人们生产生活的突变体和重组体酶做出了初步探索。实验结果如下：首先,参考已报道的原玻璃蝇节杆菌中D-氨基酸氧化酶基因(GeneBank accession No:AY306197)的信息设计了引物并加入了Nde和XhoI酶切位点,用PCR方法扩增出得到了原玻璃蝇节杆菌A. protophormiae (DSM20168)的D-氨基酸氧化酶基因(Apdaao),将其克隆到pMD-19T载体上经过DNA测序,序列正确后再将其克隆到pET22b+中获得表达载体pET Apdaao,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),对其进行诱导表达,在诱导菌初始菌浓度OD600为0.5左右时,加入0.5mM的诱导剂IPTG,在30℃下继续培养10-12h,表达D-氨基酸氧化酶。其次,我们设计了四对定点突变的引物,通过重叠法PCR和一步法PCR得到了四个突变体质粒pET-E115A、pET-N119D、pET-T256K和pET-T286A,测序正确后将突变体质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。蛋白粗提液经Ni-NTA亲和层析柱纯化后得到较纯的D-氨基酸氧化酶溶液,并进行初步的酶学特性分析研究。结果表明：本研究得到的野生型及突变型DAAO酶均在20-40℃时稳定,反应最适温度为30℃；野生型的反应最适pH值为10,突变型酶在pH值为8-9时具有较高活力；而在底物特异性方面,与已报道的来源于同菌属的DAAO相比,本研究所用DAAO存在一定差异,尤其对D-Ala、D-Phe和D-Lys的变化较为明显。