研究背景和目的：　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，简称金葡菌）是引起皮肤及软组织感染、肺炎、菌血症以及手术部位感染等多种社区和院内获得性感染的主要致病菌。由于抗生素的不合理使用，金葡菌已发展成为多重耐药菌。面对日趋严重的金葡菌感染，临床上治疗药物的选择十分有限，单纯依靠抗生素已无法有效的治疗和控制该病原菌的严重感染和耐药性蔓延，因此研制安全有效的金葡菌疫苗迫在眉睫。　　由本单位（陆军军医大学国家免疫生物制品工程技术研究中心）自主研制的基因重组五价金葡菌疫苗已于2015年获批中国食品药品监督管理总局（CFDA）“预防用生物制品1类”Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期药物临床试验批件，目前已完成了疫苗安全性与耐受性评价的Ⅰ期临床试验。　　感染动物模型是疫苗有效性评价的重要基础，它可在疫苗进一步开展的人体临床试验及推广应用中，为临床适应症及目标人群的选择、临床有效性评价及替代终点的确定提供重要的实验依据。　　在本疫苗临床前研究中，我们重点针对经血流感染金葡菌致脓毒血症（Sepsis）的动物模型进行了系统的免疫保护评价研究。为了进一步贴近临床上金葡菌感染的实际情况，拓宽后续开展Ⅱ、Ⅲ期临床试验的适应症人群选择范围，尚需建立除脓毒血症全身感染动物模型以外，不同感染途径，不同感染部位及不同疾病类型的动物模型，对本基因重组五价金葡菌疫苗进行更加全面系统地免疫保护评价。　　通过建立稳定的皮肤脓肿（Skinabscess）、肺炎（Pneumonia）及骨折内固定手术感染（Infectionafterfracturefixation，IAFF）动物模型，摸索并确定疫苗免疫保护评价的技术体系和检测指标，系统的评价基因重组五价金葡菌疫苗在上述三种感染动物模型中的免疫保护作用，同时分别从体液和细胞免疫对基因重组五价金葡菌疫苗在抗感染免疫中发挥的保护机制进行初步研究，从而加深对金葡菌感染致病机制和基因工程疫苗免疫保护机制的认识，为后期临床试验适应症人群的选择提供重要的实验支撑。　　方法：　　一、基因重组五价金葡菌疫苗在不同感染动物模型中的免疫保护评价　　1.通过皮下注射金葡菌Xen29，建立皮肤脓肿模型。于0、3、7天分别用基因重组五价金葡菌疫苗和磷酸铝佐剂对C57BL/6J小鼠进行免疫，作为疫苗组和对照组。于末次免疫后7天，使用剂量为106CFU的金葡菌Xen29感染小鼠，在感染后的14天里监测小鼠皮肤脓肿面积的变化。在感染后第2天，称量小鼠体重并计算小鼠体重变化量；通过活体动物成像系统观察小鼠皮肤细菌定植情况；取皮肤组织做HE染色切片对病理损伤进行分析。　　2.通过滴鼻感染金葡菌SA77，建立肺炎感染模型。于0、3、7天分别用基因重组五价金葡菌疫苗和磷酸铝佐剂对C57BL/6J小鼠进行免疫，作为疫苗组和对照组。于末次免疫后7天，使用剂量为3×109CFU的金葡菌SA77攻毒小鼠，在感染后的14天里观察记录小鼠的生存状况。同时，使用剂量为109CFU的金葡菌SA77感染小鼠，检测感染后12h、24h、48h以及72h小鼠血液和肺脏中细菌的定植量；取感染后72h肺脏组织做HE染色切片并进行病理学评分。　　3.股骨内固定手术后，于手术部位注射金葡菌Xen29，建立骨折内固定手术感染模型。于0、3、7天分别用基因重组五价金葡菌疫苗和磷酸铝佐剂对C57BL/6J小鼠进行免疫，作为疫苗组和对照组。末次免疫后7天，于小鼠右腿股骨进行内固定手术，并使用剂量为105CFU的金葡菌Xen29感染小鼠；在感染后的14天里观察小鼠大体的病理变化；于感染后1、3、7及14天通过活体动物成像系统观察小鼠手术部位细菌定植情况；于感染后4周，做手术侧股骨的Micro-CT扫描，观察小鼠骨折愈合情况。　　二、基因重组五价金葡菌疫苗免疫保护机制的初步研究　　1.使用ELISA法检测基因重组五价金葡菌疫苗免疫后小鼠外周血中IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体水平。　　2.使用细胞因子试剂盒检测疫苗抗原体外刺激免疫后小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN-γ,IL-5和IL-17A水平。　　3.完成基因重组五价金葡菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK检测方法中调理吞噬孵育时间、补体浓度、血清预稀释倍数等关键参数的优选，并使用该方法检测免疫后小鼠血清对MRSA252、SJZ-23、GZ-20、JN-59及CQ-19等5种不同来源金葡菌的调理吞噬杀伤作用。　　4.使用剂量为8×108CFU的金葡菌MRSA252尾静脉攻毒免疫后CD4基因敲除C57BL/6J小鼠，在感染后的7天里观察记录小鼠的生存状况。　　结果:　　一、基因重组五价金葡菌疫苗在不同感染动物模型中的免疫保护评价　　1.于小鼠背部皮下注射剂量为106CFU的金葡菌Xen29。在感染后第2天小鼠背部可观察到脓肿形成，通过活体动物成像系统能检测到细菌的定植，表明我们成功建立了金葡菌皮肤脓肿模型。　　用剂量为106CFU的金葡菌Xen29感染免疫后C57BL/6J小鼠，感染后第2天疫苗组小鼠体重减少量、皮肤细菌定植量以及皮肤组织损伤程度均小于对照组；感染后4~14天疫苗组小鼠皮肤脓肿面积小于对照组。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　2.通过滴鼻剂量为109CFU的金葡菌SA77，发现感染后12h~72h小鼠血液及肺脏均有细菌的稳定定植；观察感染后肺脏组织的HE染色切片可见肺泡结构消失，组织充血，大量炎性细胞浸润。以上结果表明金葡菌肺炎感染动物模型构建成功。　　用剂量为3×109CFU的金葡菌SA77攻毒免疫后C57BL/6J小鼠，疫苗组和对照组小鼠生存率分别为80%（8/10）和20%（2/10）。用剂量为109CFU的金葡菌SA77滴鼻感染免疫后C57BL/6J小鼠，感染后24h、48h以及72h疫苗组小鼠血液和肺脏细菌定植量均小于对照组；感染后72h疫苗组肺脏组织病理学评分小于对照组。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　3.C57BL/6J小鼠股骨内固定手术后，于手术部位注射剂量为105CFU的金葡菌Xen29进行感染，通过活体动物成像系统可观察到感染后手术部位有细菌的定植，表明我们成功建立了金葡菌骨折内固定手术感染模型。　　疫苗末次免疫后7天，于小鼠右腿股骨进行内固定手术，并使用剂量为105CFU的金葡菌Xen29感染小鼠。感染后第7天疫苗组大体病理评分小于对照组；感染后第1、3、7及14天疫苗组手术部位细菌定植量小于对照组；以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。感染后4周，Micro-CT扫描结果显示疫苗组手术部位股骨的愈合情况优于对照组。　　二、基因重组五价金葡菌疫苗免疫保护机制的初步研究　　1.基因重组五价金葡菌疫苗抗原Hla、IsdB、MntC、mSEB、SpA5可诱导机体产生高水平的IgG抗体应答，由上述抗原诱导产生的IgG抗体效价（2n）分别为16.17、15.27、16.87、14.37、15.60。比较各IgG抗体亚型，体液免疫应答主要以IgG1为主。　　2.疫苗抗原可在体外刺激免疫后小鼠脾细胞产生较高水平的IFN-γ、IL-5和IL-17A，上述三种细胞因子分泌水平分别为3606.1pg/mL、179.0pg/mL、1215.8pg/mL。　　3.确定了OPK实验的调理、吞噬孵育时间分别为30min、60min；补体浓度为6%；血清预稀释倍数为2倍。成功建立了基于基因重组五价金葡菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK的检测方法。并基于该方法，用疫苗免疫后小鼠血清对5种不同来源的金葡菌进行了OPK实验，调理吞噬指数分别为112、48、25、34及46。　　4.使用致死剂量的金葡菌MRSA252尾静脉攻毒免疫后CD4基因敲除C57BL/6J小鼠，CD4基因敲除疫苗组和疫苗组小鼠生存率分别为60%（6/10），100%（10/10），CD4基因敲除疫苗组生存率低于疫苗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　1.建立了稳定可靠的皮肤脓肿、肺炎以及骨折内固定手术感染动物模型，接种基因重组五价金葡菌疫苗后，在上述三种感染动物模型中均能产生良好的免疫保护作用。　　2.接种基因重组五价金葡菌疫苗后，可诱导机体产生高水平的体液及细胞免疫应答，产生的特异性抗体经体外调理吞噬杀伤实验证实具有良好的调理吞噬杀伤活性，CD4基因敲除小鼠的动物免疫攻毒保护实验证明疫苗诱导产生的细胞免疫应答在体内具有一定的免疫保护作用。　　3.本研究为拓宽基因重组五价金葡菌疫苗后期临床试验中适应症的选择及临床有效性评价提供了重要的实验技术支撑。