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内生真菌(Endophytic fungi)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。青梅属(Vatica genus)植物富含白藜芦醇(Resveratrol)化合物,有报道称它能阻止氧化应激引起的PC12细胞凋亡。基于内共生理论,青梅属植物青皮内生菌极有可能产生与白藜芦醇相同或相似的活性成分。我们对青皮内生菌(Phomopsi sp.)固体发酵产生的化合物进行初步筛选,结果发现细胞松弛素H(Cytochalasin H, CytH)对损伤的PC12细胞可能有潜在的保护作用。目前尚未发现对CytH该方面活性的研究报道,因此对其作用以及作用机制研究是非常必要和有意义的。帕金森病(P arkinson’s disease, PD)是一种神经系统退行性疾病,其发病原因与黑质多巴胺(Dopamine, DA)能神经元渐进性缺失有关,而凋亡是其神经元丢失的主要形式。该病的主要发病机制之一为氧化应激。CytH与上述白藜芦醇均来源于青梅属植物,它是否也能产生与后者相似的抗氧化应激作用从而对PD产生有益的影响呢?为此,本实验应用甲基苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)制备PD体外细胞模型,观察了CytH对其损伤和凋亡的影响,并对其作用机制进行了初步研究。主要结果如下：1. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞损伤的影响方法：MTT法检测PC12细胞存活率,比色法测定LDH释放率。分组及加药：(1)对照组：0.01%DMSO溶剂；(2)模型组：500μmol/LMPP+;(3)阳性药组：100μmol/L司来吉兰；(4)受试药物组：不同浓度CytH。受试药和阳性药采用3种加药方法：①预处理：先向PC12细胞中加入药物培养4h后再加入Mpp+；②后干预：Mpp+作用4h后再加药；③同时干预：药物与MPP+同时加入。各组Mpp+作用时间均持续48h。结果：(1) CytH化合物细胞毒性：与对照组比较,0.00125～2μmol/L CytH组细胞存活率均无显著性降低。在0.05,0.1,0.2μmol/L时,CytH反使PC12细胞存活率增加,分别为118.22%±4.29%,119.00%+7,33%,118.48%±6.85%,与对照组相比,均具有显著性差异(P<0.01)。表明CytH化合物不仅没有细胞毒性,反而能够促进神经细胞增殖。(2)CytH化合物预处理对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH预处理在0.001～0.01μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.939、P<0.01), CytH浓度为0.01μmol/L时存活率达到103.7%±0.3%(P<0.001)。CytH (0.0025～0.01μmol/L)预处理LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.946、P<0.01),与模型组比较差异有显著性(P<0.01,0.001)。(3)CytH化合物后干预对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH后干预在0.01～0.15μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.890、P<0.01), CytH浓度为0.15μmol/L时存活率达到104.3%±2.4%(P<0.001)。CytH (0.01～0.2μnmol/L)后干预LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.858、P<0.01),与模型组比较差异有显著性(P<0.01,0.001)。(4) CytH化合物同时干预对MPP十诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH同时干预在0.05～0.2μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.885、P<0.01), CytH浓度为0.2μmol/L时存活率达到96.60%±4.6%(P<0.001)。CytH (0.05～0.2μmol/L)同时干预LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.913、P<0.01),与模型组比较差异有显著性(P<0.01,0.001)。结论：CytH化合物对Mpp+诱导的PC12细胞损伤有一定的预防、治疗和修复作用。2.Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用方法：分组同上,采用同时干预法加药。应用透射电镜观察细胞超微结构,AO/EB荧光染色观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞凋亡比率。结果：(1)透射电镜下细胞超微结构：电镜结果显示,Mpp+作用后可见细胞发生凋亡的形态学改变：细胞表面的微绒毛减少或者消失；细胞核膜皱缩,细胞核体积缩小；染色质致密并凝聚成块状聚于细胞核周边；细胞质中可见线粒体明显肿胀,甚至产生空泡状改变。经过0.05,0.1,0.2μmol/L CytH干预,与模型组相比,细胞的超微结构趋于正常,细胞核膜清晰,核内染色质相对正常,细胞质中可见正常完整的细胞器,尤其高浓度组与正常组较为接近。结果表明CytH各剂量组能够部分改善PC12细胞的变化,减少细胞器的丢失。提示CytH能改善Mpp+诱导的PC12细胞超微结构的变化。(2) AO/EB荧光双染法观察细胞凋亡：正常组细胞大多呈长梭形,核质体被均匀染成绿色,部分细胞荧光强度变暗；模型组细胞大多呈椭圆形,核质体被均匀染成橙色或亮黄色；阳性药物组以及CytH各剂量组(0.05,0.1,0.2μmol/L)均能不同程度改善这一现象,其中高剂量组作用最明显,效果接近于司来吉兰阳性药物组。结果表明CytH对MPP+诱导的PC12细胞凋亡有一定的保护作用。(3)流式细胞仪分析PC12细胞凋亡比率：模型组早期凋亡细胞较对照组显著升高(P<0.05),晚期凋亡或坏死细胞(P<0.01)及总凋亡率(P<0.001)也呈显著增加；CytH各剂量组(0.05,0.1,0.2μmol/L)与模型组相比,活细胞数明显增多(P<0.01,0.001),总凋亡率显著下降(P<0.001),且呈剂量依赖性(r=-0.754、P<0.05)。结果表明CytH能降低MPP+诱导的PC12细胞的凋亡率。结论：CytH化合物能够一定程度上抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。3. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激的影响方法：分组同上,采用同时干预法加药。应用流式细胞仪测定细胞内ROS；采用硫代巴比妥酸(TBA)、黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法测定细胞中MDA含量和SOD2、GSH-PX酶活力；还原法检测细胞总抗氧化能力(T-AOC)。结果：(1)CytH对细胞内ROS的影响：与对照组(ROS含量比值为1)相比,500Hmol/LMPP+使细胞内ROS含量比值升高至1.91±0.15(P<0.001).0.05,0.1,0.2μmol/L CytH干预后,ROS含量比值下降为1.78±0.23(P>0.05),1.07±0.3(P<0.05),0.91±0.37(P<0.05),100μmol/L司来吉兰组为1.18±0.13(P<0.01)。表明CytH能抑制MPP+升高ROS含量的作用,并呈剂量依赖性(r=-0.780、P<0.05)。(2) CytH对细胞内MDA含量的影响：模型组MDA含量为24.48±3.51nmol/mgprot,与对照组相比呈显著性升高(P<0.01), CytH0.0125、0.025、0.05.0.1、0.2μmol/L组以及司来吉兰组与模型组比较,MDA含量均有显著性下降(P<0.05),其中以CytH0.05μmol/L效果最好,MDA含量仅为3.23±1.42nmol/mgprot。表明CytH能明显抑制MPP+诱导的PC12细胞MDA含量的升高。(3) CytH对细胞内T-AOC、SOD和GSH-PX活性的影响：模型组T-AOC、SOD和GSH-PX活性分别为0.9±1.56U/mgprot (P<0.01),19.49±4.36U/mgprot (P<0.001),507.6±67.3U/mgprot (P<0.001),与对照组比较呈显著性下降。与模型组相比,CytH0.05,0.1、0.2μmol/L三个剂量组均能显著升高T-AOC活性(P<0.01,P<0.001)；升高SOD活性作用在中剂量和高剂量组有显著性差异(P<0.05、P<0.001)；但升高GSH-PX活性的作用仅在高剂量组有显著性差异(P<0.001)。CytH高剂量组三种物质的活性分别为：T-AOC10.47±0.75U/mgprot(P<0.001), SOD81.25±3.79U/mgprot(P<0.001), GSH-PX1063.18±53.7U/mgprot (P<0.001)。表明CytH能明显升高PC12细胞中T-AO、SOD和GSH-PX活性。结论：CytH化合物能够提高PC12细胞内T-AOC、SOD和GSH-PX活性,减少MDA含量和ROS的产生,可能通过抗氧化应激作用而抑制Mpp+诱导的PC12细胞凋亡。4. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用的分子机制研究方法：分组同上,采用同时干预法加药。细胞处理后提取蛋白。利用BCA法进行蛋白定量,应用Western blot法测定Bcl-2、caspase3蛋白表达。结果：(1) CytH对Mpp+诱导的PC12细胞中Bcl-2表达的影响：与对照组相比模型组中Bcl-2表达有较大下降,CytH (0.05,0.1,0.2μmol/L)干预后,高剂量组可以抑制Bcl-2表达的下降,司来吉兰组亦有相类似作用。(2) CytH对MPP+诱导的PC12细胞中Caspase-3表达量的影响：Caspase-3受到某些因素的由前体产生有酶活性的片段,此过程为Caspase-3的活化。与对照组相比,模型组中35kD的Caspase-3的活化水平显著增强,CytH (0.05,0.1,0.2μmol/L)干预后Caspase-3与模型组相比活化程度降低,表明Mpp+可以诱导Caspase-3活化,并促发细胞凋亡效应；而CytH可以通过减少Caspase-3的活化来减少PC12细胞的凋亡。结论：CytH可通过上调Bcl-2蛋白表达、抑制Caspase-3的活化而抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。CytH对Mpp+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用的分子机制可能涉及对Bcl-2家族蛋白表达水平的影响及对Caspase蛋白水解酶的活化的调节。