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流行性感冒(Influence)是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性、接触性呼吸道疾病。流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae),负链RNA分节段病毒。根据保守的内部蛋白(主要为NP和基质蛋白M)的血清学反应将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。流感病毒可以感染包括人、马、猪、水生哺乳动物和禽类在内的多种动物。二十世纪四次大流行和近年来突破种间屏障高致病性禽流感的发生严重影响了人类社会安定,并引起巨大的经济损失。近年来,随着我国人流感流行规律的变化,发病率上升,使流感的防制越来越重要。当前流感疫苗是防治流感的主要手段。五十多年来,流感疫苗制备的方法得到了很大的发展。尤其近年来,以冷适应减毒株为背景,反向遗传学技术为基础,拯救重配流感病毒弱毒活疫苗株,进而研发新一代的流感弱毒活疫苗成为当今流感疫苗研究的热点。本研究基于本实验室构建的冷适应病毒拯救系统,利用反向遗传学技术,将冷适应流感病毒株A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)的六个内部基因和WHO公布的2006～2007年A型流感病毒流行株A/New Caledonia/20/99(H1N1)的两个外部基因进行了重配,拯救出既具有冷适应和温度敏感表型,又具有流行株抗原性的重配病毒rMDV-H1。以重配病毒为抗原,通过鼻腔途径免疫小鼠,测定了小鼠血清的血凝抑制抗体,血清IgG,进行IgG亚类分析和鼻、肺及阴道冲洗液中sIgA,从而对重配病毒的免疫原性进行了初步的鉴定,为我国流感弱毒疫苗的研究提供一定的依据。1. 2006—2007流行株A/New Caledonia/20/99(H1N1)冷适应株rMDV-H1的拯救。RT-PCR扩增A/New Caledonia/20/99(H1N1)的HA和NA基因,连接pMD-19T载体并测序,将序列正确的HA和NA基因酶切后克隆至双向转录/表达载体pAD3000上,分别与带有PR8的六个内部基因的质粒共转染COS-1细胞,33℃、5% CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96 h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝效价的“7+1”重配病毒,验证了pMVD-H1HA、pMVD-H1NA的功能。将验证好的质粒pMVD-H1HA、pMVD-H1NA分别与带有冷适应株的六个内部基因的质粒共转染COS-1细胞,33℃、5%CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96 h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝性的重组病毒,即rMDV-H1。2.冷适应候选株rMDV-H1的生物学特性的初步鉴定。对重组病毒rMDV-H1的生物学特性进行初步研究。包括稳定性试验,细胞病变(CPE)的观察,间接免疫荧光试验(IFA),使用鸡胚半数感染量(EID50)和半数组织感染量(TCID50)进行毒力的测定。3.冷适应候选株rMDV-H1免疫原性的初步研究。将rMDV-H1第四代鸡胚尿囊液接种10日龄SPF鸡胚100枚(0.25mL/胚),33℃孵育72 h,收获血凝效价≥28的鸡胚尿囊液,经超高速蔗糖梯度离心法浓缩纯化抗原。使用鸡胚半数感染量(EID50)和半数组织感染量(TCID50)测定纯化后抗原的毒力。根据EID50和TCID50的实验结果,将20只6～8周龄的Balb/c雌性小鼠分为四组,每组5只,接种抗原量依次为0、0.05EID50、0.1EID50和0.05EID50。接种途径分为皮下注射和鼻腔接种。第1次免疫后14 d加强免疫1次。采集第2次免疫后7 d、14 d血清,经HIA试验和间接免疫酶联吸附试验(ELISA)分别测定血凝抑制抗体和特异性血清抗体IgG,并进行IgG1、IgG2a和IgG2b亚类分析。采集第2次免疫后14 d肺、鼻和阴道冲洗液,经ELISA测定局部分泌性sIgA。