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近年来,能源危机以及环境问题的日益严峻使得开发新型可再生能源以替代传统石化资源成为亟待解决的全球性问题。丁醇以其可以和汽油混合用于清洁能源,并具有能量密度高、腐蚀性小等诸多优于乙醇之处,已成为各国学者研究的热点。目前,丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobuylicum)菌种选育和发酵工艺的改进已经取得较大的进步。但目前大部分丁醇发酵菌株均为严格厌氧型,对仪器设备有很严格的要求。本室利用梭菌强化培养基,从玉米粉中筛选出一株产丁醇的芽孢杆菌,将其原生质体进行辐照诱变后,利用梭菌强化培养基筛选出一株丁醇产量较高且遗传性状稳定的兼性厌氧菌株Bacillus.TSHl(B.TSH1)。为了对B.TSH1继续进行改造以进一步提高丁醇产量和得率,本文对B.TSH1 丁醇代谢途径中的关键酶进行了研究。本文首先对B.TSH1在不同通空气条件下的发酵结果进行对比。葡萄糖在产酸期主要用于菌体的生长和酸的生成,产溶剂期主要用于溶剂的生成,在产溶剂阶段,乙酸、丁酸被菌体重新利用,分别生成乙酰辅酶A和丁酰辅酶A。在36.33 g/L的初糖浓度下,溶剂在12 h开始产生,发酵在36 h终止。发酵结束后,丙酮(Acetone)、丁醇(Buanol)和乙醇(Etanol)的比例约为A:B:E= 2:7:1。丁醇的质量得率为19.6%,终产量为7.13 g/L,占ABE总量的70%。其次,测定了B.TSH1关键节点处关键酶的酶活变化。乙醇脱氢酶比活在12 h达到最大值0.054 U/mg,丁醇脱氢酶在15 h达到最大值0.055 U/mg,丁醛脱氢酶和辅酶A转移酶在21 h分别达到最大值0.035 U/mg和11900 U/mg,而乙酰乙酸脱羧酶则在发酵结束时比活达到最大值7.46 U/mg。通空气条件下(0.05 vvm)的关键酶比活均比不通气条件下要高,且比酶活最大值出现的时间相对不通气条件下要晚(乙酰乙酸脱羧酶相反)。在半定量条件下,B.TSH1中关键酶巴豆酸酶(ct)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(hbd)等在发酵的整个阶段均在RNA水平有恒定的表达,此外,乙酰乙酸脱羧酶(adc)在产酸期的表达量非常微弱,在产溶剂期表达量略有增加。乙酸激酶(ak)主要在菌体代谢的前期发挥作用;在丁酰辅酶A生成丁酸的代谢支路上,丁酸激酶(bk)发挥主要作用;三种乙醇脱氢酶(adh),三种丁醇脱氢酶(bdh)和两种硫激酶(thl)均有表达,adhl,bdh和thlp B整体表达量相对较多且整个过程中表达量基本稳定,在整个发酵过程中起相对主要的作用。在丁醇产量达到4g以上,并且产丁醇速率开始增加时,热激蛋白抑制剂开始发挥作用。最后,本文对B.TSH1不同发酵阶段的样品进行了蛋白组学分析,在产酸期的双向电泳斑点数上调三倍以上的点为20个,产有机溶剂期双向电泳斑点数为4个。