宁夏地区牛支原体分型鉴定及其对牛外周血单核巨噬细胞的功能影响研究

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牛支原体病是一种具有高度传染性的疫病,由于缺少有效的预防控制措施,目前呈世界范围内流行,在我国已成为了一种牛常见性疫病。宁夏回族自治区是我国的肉牛和奶牛主要养殖地区,养牛水平和生产性能名列中国前茅。近些年,由于牛支原体病在宁夏各地不断发生,严重影响了宁夏地区养牛业的绿色健康发展。本论文开展了宁夏地区牛支原体病进行流行病学调查、牛支原体流行菌株的菌群结构分析、牛支原体对牛外周血单核巨噬细胞凋亡影响机制和抗原加工递呈机理的研究,研究结果如下:1.采用ELISA方法对2016年~2018年宁夏全部县区1980份血清进行检测。结果显示,宁夏22个县区牛支原体检出率为100%,3年间牛支原体血清阳性率呈现增长的趋势,年度差异显著(P<0.05)。吴忠市牛支原体阳性率最高,不同县区间存在差异。流行病学调查说明了宁夏地区牛支原体感染普遍存在,且感染率呈现逐年增长趋势。2.为了调查引起宁夏地区牛支原体普遍感染的菌群结构,采用多位点序列分型(MLST)法对2009年至2018年从宁夏不同地区分离的65株菌株进行分型并与国内不同ST型菌株和国际菌株PG45进行联合分析。结果表明,宁夏地区仅有2种ST型,ST10和ST134。构建的进化树揭示了3 个不同的系谱,ST26 的 Hubei-1 菌株、ST172 的 HBHS01 和 Shananxi04 菌株、ST43的NHD0966和EZ-2菌株均与ST10的菌株在同一系谱;PG45菌株(ST17)与NMH7菌株(ST173)在同一系谱;ST134(43.1%)是单独的一个系谱。ST134菌株是新的ST菌株,于2009年首次发现并且目前仅在宁夏地区广泛分布。ST10菌株在中国许多省份广泛传播,自2010年以来在宁夏广泛传播。3.为了研究不同ST型牛支原体对牛外周血单核巨噬细胞(BMDMS)凋亡和免疫功能的影响,本研究采用3种不同ST型牛支原体按照不同的感染复数感染BMDMS,并在4个不同时间点进行凋亡、活性氧和免疫因子检测。结果显示不同ST型牛支原体感染BMDMS均抑制其凋亡,与ST型无关。牛支原体可以抑制ROS的释放。牛BMDMS通过释放IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23和INF-α因子等细胞因子起到引起炎症反应和免疫杀伤作用,均在感染后6h抗体含量增大,之后下降,18h增多,24h下降。4.采用蛋白质组学和转录组学技术对牛支原体感染BMDMS后检测其胞内蛋白变化,并进行差异蛋白筛选、功能分析、信号通路分析及凋亡和抗原加工递呈相关蛋白差异性分析。结果显示,牛支原体感染BMDMS后可以抑制凋亡蛋白BAX的下调和促进BCL-2凋亡抑制蛋白合成进而抑制牛外周血单核巨噬细胞的凋亡,促进细胞的存活;CDK9的显著上调和NELF的下调促进了BCL-2的持续性转录和翻译;牛支原体可以通过抑制依赖Caspase的细胞凋亡途径抑制BMDMS的凋亡;钙离子水平和细胞色素C变化无差异,再次证明了牛支原体可以通过抑制BAX和Caspase8介导的内质网通路和线粒体通络,进而抑制细胞凋亡;AIF的显著性下调抑制了 DNA片段化。CapG蛋白显著下调,影响了 BMDMS的移动,进而影响BMDMS分泌MHCⅡ。BOLA-DR蛋白量下调,HLA-DM蛋白量显著下调,CD74/Ii链含量显著下调,说明了牛支原体可以抑制BMDMS对牛支原体的加工和递呈作用逃逸宿主细胞的杀伤进而使牛支原体可以在宿主细胞存活。Nramp1蛋白显著下调,进而影响了巨噬细胞对病原微生物的杀伤性进而使牛支原体病原可以在其胞内持久存活。
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