【摘 要】
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目的:在哺乳动物睾丸的发育过程中,支持细胞（Sertoli cells,SCs）对间质细胞（Leydig cells,LCs）的发育和功能起着重要的调节作用。在这个过程中,存在两类不同发育阶段的支持细胞--未成熟支持细胞（Immature Sertoli cells,ISCs）和成年支持细胞（Adult Sertoli cells,ASCs）。然而,不同发育阶段的SCs对LCs功能的调控方式是否存
【基金项目】
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国家自然科学基金（81871150、31801235、82071634）; 广东省自然科学基金（2018A030313473）; 广州市基础与应用研究项目（202002030168）
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目的:在哺乳动物睾丸的发育过程中,支持细胞（Sertoli cells,SCs）对间质细胞（Leydig cells,LCs）的发育和功能起着重要的调节作用。在这个过程中,存在两类不同发育阶段的支持细胞--未成熟支持细胞（Immature Sertoli cells,ISCs）和成年支持细胞（Adult Sertoli cells,ASCs）。然而,不同发育阶段的SCs对LCs功能的调控方式是否存在差异目前尚未明确。本研究明确了不同阶段SCs的差异miRNA,即miR-145a-5p,并研究miR-145a-5p对LCs的睾酮合成功能的调控作用和方式。方法:体外实验:（1）利用胶原酶和胰蛋白酶的两步酶解法分别从4周龄或8周龄的小鼠睾丸中分离SCs和LCs,并使用ISCs或ASCs的条件培养基上清处理ALCs,q PCR检测ALCs睾酮合成相关基因表达变化;（2）q PCR和原位杂交实验验证ISCs和ASCs的差异miRNA,并以miR-145a-5p作为研究对象进行后续研究;（3）miR-145a-5p模拟物（mimic-miR-145）或抑制剂（inhibitor-miR-145）转染LCs,放射性免疫（RIA）检测培养基上清睾酮水平变化,q PCR检测睾酮合成相关基因表达变化,油红O染色观察细胞内脂滴形态;（4）使用miRNA靶点预测数据库（Target Scan.org）预测miR-145a-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验确定miR-145a-5p的靶基因;mimic-miR-145转染LCs,q PCR和Western blot进行靶点验证;（5）利用外泌体分离试剂分离ISCs和ASCs的外泌体,透射电镜（TEM）观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析系统（NTA）分析外泌体的粒径,Western blot检测外泌体标记蛋白的表达;（6）分别用ISCs和ASCs的外泌体处理ALCs,q PCR检测LCs睾酮合成相关基因表达差异;（7）FAM标记的miR-145a-5p转染ISCs后与LCs共培养,并在ISCs培养基中加入外泌体抑制剂GW4869,验证miR-145a-5p由SCs通过外泌体途径转运至LCs中,Western blot验证LCs的靶蛋白是否出现下调。体内实验:（1）使用miR-145a-5p的体内激动剂Agomir-145或拮抗剂Antagomir-145对小鼠睾丸进行注射,RIA检测血清睾酮水平变化,Western blot检测靶基因的蛋白表达水平;（2）TUNEL和HE染色观察睾丸组织状态,油红O染色观察LCs胞内脂滴形态。结果:（1）miR-145a-5p在ISCs的表达量高于ASCs,对LCs转染mimic-miR-145可以抑制睾酮合成途径基因Star、Cyp11a1、Hsd3b1和Hsd17b3的表达并导致LCs细胞内产生脂质积累,降低LCs培养基上清中的睾酮水平。而对LCs转染inhibitor-miR-145的作用则与之相反。（2）miR-145a-5p的靶基因为Sf-1,抑制Sf-1的表达可导致下游的睾酮合成相关基因Star、Cyp11a1、Hsd3b和Hsd17b3的表达水平下调并导致LCs细胞内产生脂质积累。（3）使用ISCs来源的外泌体处理LCs可以抑制睾酮合成途径基因Sf-1、Star、Cyp11a1和Hsd17b3的表达,而ASCs来源的外泌体作用则与之相反。（4）miR-145a-5p在ISCs外泌体中的表达量与在ISCs中的表达量成正相关,抑制ISCs外泌体的分泌使miR-145a-5p进入LCs中的量显著减少。结论:miR-145a-5p在ISCs中高表达并通过ISCs外泌体转运至LCs,靶向Sf-1的3’-UTR,抑制Sf-1的表达,下调睾酮合成相关酶的表达,最终抑制睾酮的生成。
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