[背景和目的]:肺癌作为死亡率和发病率排名第一的恶性肿瘤,已成为目前威胁全球健康的主要疾病,其中非小细胞型肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)占全部肺癌病例数的80%,成为严重威胁人民群众健康的重大疾病。我国肺癌发病率较高的云南宣威地区具有非常显著的流行病学特征,该地区来宾镇的女性肺癌发病率是我国平均水平的20倍,结合该地区的生活方式(开放式火塘),及科学家在该地区的地质研究结果,证实了宣威地区肺癌高发与当地燃煤的燃烧产物存在关联。室内污染作为宣威肺癌病因研究的主要对象,燃煤产物内的纳米二氧化硅是该地区燃煤室内污染的主要成分,其特殊的微观结构及形成条件受到国内外学者关注。在前期研究中,课题组在宣威地区肺腺癌患者肿瘤组织中发现miR-501-5p的表达水平明显上调,在宣威地区肺腺癌组织中发现了纳米二氧化硅颗粒,并且细胞毒性试验提示纳米二氧化硅能上调miR-501-5p的表达水平,揭示了纳米二氧化硅-miR-501-5p-宣威肺腺癌三者可能存在一定联系。miR-501-5p在宣威肺癌的发生发展中是否发挥作用,以及对肺腺癌细胞功能的影响及其具体调节机制均不清楚。本研究的目的:通过对肺腺癌配对组织进行microRNA芯片检测,筛选出宣威地区肺腺癌特异microRNA,建立microRNA表达谱;检测癌组织及血清中miR-501-5p的表达水平,分析其表达水平与临床因素的关系;通过体外细胞实验,下调miR-501-5p的表达水平以观察对细胞增殖,迁移,侵袭及凋亡抵抗的影响;初步研究miR-501-5p的靶基因及信号通路。通过以上研究探讨miR-501-5p在NSCLC中扮演的角色及其作用机制。第一部分:宣威地区肺腺癌病人肺组织特异microRNAs表达谱和靶基因及其信号通路预测[目的]:建立宣威地区肺腺癌病人肺组织特异microRNAs表达谱,进行靶基因及其信号通路预测。[方法]:对宣威地区肺腺癌组织标本(24对)及非宣威地区肺腺癌组织标本(10对)进行microRNA芯片检测,运用qPCR技术对芯片结果进行验证。以筛选出宣威地区肺腺癌差异表达的microRNA,建立宣威地区肺腺癌病人肺组织特异microRNA表达谱,利用生物信息学预测靶基因及信号通路。[结果]:1.microRNA芯片检测结果:与宣威地区正常肺组织相比,在宣威地区肺腺癌差异表达的microRNA有153个,上调有64个,下调有89个。与非宣威地区正常肺组织相比,在非宣威地区肺腺癌存在差异表达的microRNA有83个,上调有2个,下调有81个。2.芯片验证结果:与正常组织相比,在肺癌组织中异常表达的microRNA的芯片检测与qPCR检测结果为(芯片值,qPCR相对定量):hsa-miR-21-3p(2.564,15.134),hsa-miR-182-5p(2.426,16.625),hsa-miR-210-3p(2.742,17.625),hsa-miR-30a-5p(0.288,0.307),hsa-miR-126-5p(0.259,0.398),2种方法检测的上/下调趋势一致,支持芯片结果可信。3.宣威地区肺腺癌特异microRNA表达谱;仅在宣威肺腺癌出现差异表达的microRNA 有 34 条,上调有:hsa-miR-504-5p、hsa-miR-501-5p、hsa-miR-147a、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-325、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-33b-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-595、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-558、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-519d-3p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-645、hsa-miR-938 和 hsa-miR-135b-5p;下调有:hsa-miR-598-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-497-5p,hsa-miR-585-3p、hsa-miR-30c-5p和hsa-miR-363-3p。生物信息学分析提示宣威地区肺腺癌特异microRNA与信号通路PI3K/Alt,WNT和MAPK存在一定的关系。[结论]:宣威肺腺癌中存在特异性microRNAs,并可能通过PI3K/Alt,WNT和MAPK信号通路在宣威肺腺癌演进过程中起重要作用。第二部分miR-501-5p在宣威地区肺腺癌中的表达及临床意义研究[目的]:了解miR-501-5p在宣威地区肺腺癌患者癌组织和血清的表达水平,并探讨与临床因素之间关系。[方法]:运用qPCR技术检测24例宣威地区肺腺癌患者肿瘤组织标本中miR-501-5p的表达水平,以及42例肺腺癌患者和17例良性肿瘤患者血清中miR-501-5p的表达水平。结合患者临床因素(年龄,性别,肺癌分期及血清CEA值),对miR-501-5p的表达水平与患者临床因素进行相关性分析。[结果]:1.miR-501-5p在肺腺癌与正常肺组织中的表达量分别为(均数±标准差),QPCR 检测相对表达量为:3.937±4.507 和 1.000±1.257(t=3.076,p<0.01);芯片检测为 1.439±2.004 和 0.454±0.323(t=-2.449,p<0.05)。均提示miR-501-5p在肺腺癌组织中呈高表达。2.miR-501-5p在宣威地区肺腺癌患者,非宣威地区肺腺癌患者及良性肿瘤患者血清中相对表达量分别为(均数±标准差)3.603±2.325,2.420±1.949和2.302±1.899,三者之间无统计学差异(p>0.05),无差异性表达。3.组织样本中miR-501-5p的表达水平与宣威地区肺腺癌患者年龄,肿瘤分期,淋巴结转移及血清CEA的值相关,在<65岁与≥65岁患者的癌组织中相对表达量分别是:0.953±1.373,3.286±3.037(F=7.168,p<0.05);在Ⅰ-Ⅱ期患者与Ⅲ-Ⅳ期患者癌组织中相对表达量分别为:0.505±0.246,4.240±2.392(F=36.627,p<0.01);在无淋巴结转移患者与淋巴结转移患者的癌组织中相对表达量分别为:0.513±0.241,4.217±2.437(F=51.337,p<0.01);在术前血清 CEA(癌胚抗原)值<5ng与≥5ng患者的癌组织中相对表达量为:0.642±0.745,3.375±2.784(F=30.045,p<0.01)。多重线性回归分析提示miR-501-5p的表达水平与患者的年龄,术前血清CEA值及肿瘤分期呈正相关。[结论]:miR-501-5p在宣威地区肺腺癌组织中呈高表达,并且表达水平与患者临床因素(患者年龄,肿瘤分期,淋巴结转移及术前血清CEA)相关,可能参与宣威肺腺癌的发生发展。第三部分miR-501-5p对非小细胞型肺癌细胞株A549、XWLC-05生物学行为的影响[目的]:探讨下调miR-501-5p对非小细胞型肺癌细胞A549、XWLC-05增殖,迁移侵袭及抗凋亡能力等生物学功能的影响。[方法]:运用qPCR技术检测肺癌细胞A549,XWLC-05,H1975,GLC,YTLMC的miR-501-5表达量,筛选出miR-501-5p高表达的肺癌细胞。对A549、XWLC-05细胞进行慢病毒载体 LV3(Hl/GFP&Puro)-hsa-miR-501-5P sponge inhibitor 转染,利用qPCR技术和荧光显微镜了解转染后24h的干扰效果,进行稳定转染A549、XWLC-05细胞筛选,进行细胞增殖,迁移及侵袭能力的检测。并使用流式细胞技术对转染慢病毒载体 LV2(U6/Puro)-has-miR-501-5p sponge inhibitor48h 后的A549、XWLC-05细胞进行细胞凋亡及细胞周期的检测。[结果]:1.与BEAS-2B细胞中miR-501-5p表达水平相比,miR-501-5p在肺癌细胞株A549与XWLC-05的相对表达量分别是(均数±标准差)2.827±1.799和2.309±0.364,p<0.05,倍数均大于 2 倍(p<0.05)。2.在转染miR-501-5p干扰慢病毒后24h,qPCR检测结果是:miR-501-5p在A549细胞NC组与inhibitor组的相对表达量分别是:1.000±0.182,0.163±0.044(t=-7.758,p<0.05);miR-501-5p 在 XWLC-05 细胞 NC 组与 inhibitor组的相对表达量分别是:1.000±0.273,0.212±0.094(t=4.734,p<0.05)。荧光显微镜观察发现A549、XWLC-05细胞转染效率均大于50%。慢病毒载体inhibitor在A549与XWLC-05细胞的转染达到干扰效果。3.肺癌细胞的功能实验结果:①下调miR-501-5p能抑制A549、XWLC-05细胞的增殖能力,在A549细胞稳转细胞铺板24h后(第1天到第6天)均出现抑制,其差异显著(p<0.05)。在XWLC-05稳转细胞是在铺板后第3天出现抑制,在第4天至第6天差异显著,有统计学意义(p<0.01)。②下调miR-501-5p能抑制A549、XWLC-05细胞的迁移能力,在稳转细胞铺板48h后,A549细胞的NC组与inhibitor组迁移细胞数分别是:466±188.4和 191.1±49.4,差异有统计学意义(p<0.05),XWLC-05 的 NC 组与 inhibitor组迁移细胞数分别是:477.8±110.2和249.3±89.2,差异有统计学意义(p<0.05)。③下调miR-501-5p能抑制A549、XWLC-05细胞的侵袭能力,在稳转细胞铺板48h后,A549细胞的NC组与inhibitor组侵袭细胞数分别是:170.5±23.4和 126.1±53.2,差异有统计学意义(p<0.05),XWLC-05 的 NC 组与 inhibitor组侵袭细胞数分别是:230.4±20.1和185±26.2,差异有统计学意义(p<0.05)。④下调miR-501-5p能抑制A549、XWLC-05细胞的抵抗凋亡的能力,转染48h后,A549细胞的NC组与inhibitor组凋亡细胞数比例分别是:5.810±3.500(%)和 16.850±6.547(%),差异有统计学意义(p<0.05),XWLC-05 的NC组与inhibitor组凋亡细胞数比例分别是:7.923±1.374(%)和13.140±4.923(%),差异有统计学意义(p<0.05)。⑤下调miR-501-5p对A549、XWLC-05细胞的G0/G1,S,G2/M期无显著影响(p>0.05)。[结论]:miR-501-5p在A549、XWLC-05呈高表达,下调miR-501-5p可以抑制肺癌细胞A549、XWLC-05增殖,转移及侵袭,和抵抗凋亡的能力。MiR-501-5p可能在非小细胞肺癌的发生发展中发挥着促进作用,扮演着癌基因的角色。第四部分miR-501-5p在非小细胞型肺癌中的靶基因及信号通路的初步研究[目的]:探讨miR-501-5p在非小细胞型肺癌中的靶基因及所调控的信号通路。[方法]:通过生物信息学对miR-501-5p进行靶基因及信号通路的预测,运用qPCR技术及蛋白印记技术检测下调miR-501-5p后,肺癌细胞A549、XWLC-05内预测靶基因和信号通路相关基因的mRNA表达水平,以及信号通路相关基因蛋白的表达水平。[结果]:1.生物信息学预测miR-501-5p的靶基因有:DCC,UBAP1,ERRFI1;预测的信号通路是癌症相关信号通路和WNT信号通路。2.靶基因验证结果:下调miR-501-5p后,A549细胞中预测靶基因DCC,UBAP1,ERRFI1在inhibitor组与NC组的mRNA相对表达量分别是(0.803±0.539,1.000±0.788,p>0.05);(1.157±1.242,1.000±0.785,p>0.05);(0.804±0.387,1.000±0.515,p>0.05)。XWLC-05 细胞中预测靶基因 DCC,UBAP1,ERRFI1在inhibitor组与NC组的mRNA相对表达量分别是(0.922±0.702,1.000±0.671,p>0.05);(0.820±0.528,1.000±0.622,p>0.05);(1.117±0.440,1.000±0.549,p>0.05)。下调 miR-501-5p 对 DCC,ERRFI1,UBAP1基因在A549和XWLC-05细胞中mRNA表达无明显影响。3.下调 miR-501-5p 后,WNT 信号通路相关基因β-catenin,APPL1,LRP6,GSK-3β在A549细胞inhibitor组与NC组的mRNA表达量分别是:(0.150±0.075,1.000±0.494,p<0.05);(0.109±0.023,1.000±0.354,p<0.05);(0.123±0.040,1.000±0.254,p<0.05);(0.557±0.746,1.000±1.177,p>0.05)。下调 miR-501-5p 后,WNT 信号通路相关基因β-catenin,APPL1,LRP6,GSK-3β在XWLC-05细胞inhibitor组与NC组的mRNA表达量在分别为:(0.132±0.050,1.000±0.350,p<0.05);(0.090±0.079,1.000±0.435,p<0.05);(0.112±0.022,1.000±0.431,p<0.05);(0.648±0.332,1.000±0.606,p>0.05)。下调 miR-501-5p 可以降低 A549 及 XWLC-05 细胞中β-catenin,APPL1,LRP6基因的mRNA表达水平,对GSK-3β的表达无明显影响。4.下调 miR-501-5p 后,A549、XWLC-05 细胞中的 LRP6,APPL1,β-catenin蛋白表达水平明显降低,Caspase-3蛋白表达水平升高。[结论]:DCC,ERRFI1,UBAP1是miR-501-5p靶基因的可能性较小,下调miR-501-5p可以降低LRP6,APPL1,β-catenin的mRNA及蛋白的表达水平,提高caspase-3的蛋白表达水平。miR-501-5p可能是通过激活WNT/β-catenin信号通路,实现对肺癌细胞A549,XWLC-05生物学功能的促进作用。