论文部分内容阅读
目的:氟是人体生长发育所必需的微量元素,适量的氟可以增强牙齿的抗龋能力,但机体长期摄入过量氟会引起地方性氟中毒。由于骨组织是氟主要的靶器官,因此过量氟引起的氟骨症是最具代表性的,软骨损伤是该症的基本表现之一。软骨形成过程受到全身激素、细胞因子和局部信号通路的共同调控。生物钟是指生理学和行为的每日24小时节律,由外部时间线索产生的正、负反馈回路组成。正反馈回路由转录因子Clock和Bmal1组成,负反馈回路由转录因子Per和Cry组成。氟对软骨形成过程增殖、分化的影响以及氟是否通过生物钟信号通路调控软骨形成过程尚未见报道。为此,我们通过大鼠孕哺期染毒的初断乳仔鼠和小鼠ATDC5细胞,初步探索氟对ATDC5细胞体外分化过程的影响和生物钟信号通路在其中发挥的作用。本研究拟为阐明氟抑制长骨生长的机制提供线索,为氟骨症的防治提供理论依据。实验方法:本研究选取孕哺期染毒的Wistar初断乳仔鼠,通过免疫组织化学染色检测大鼠生长板软骨中Bmal1蛋白的表达。本研究采用CCK8法确定氟抑制ATDC5细胞增殖的染毒剂量,在胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠诱导剂的作用下诱导ATDC5细胞分化,采用阿利新蓝染色法检测蛋白多糖合成情况,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹检测软骨分化相关标志因子（Sox9、Col2a1、Aggrecan、Ihh、Col10a1）和生物钟信号通路相关因子（Bmal1、Clock、Per1、Cry1）的mRNA和蛋白表达情况;并筛选出Bmal1基因稳定过表达的ATDC5细胞系,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹检测软骨分化相关标志因子（Sox9、Col2a1、Aggrecan、Ihh、Col10a1）的mRNA和蛋白表达情况。结果:1、氟对大鼠生长板软骨细胞Bmal1蛋白表达的影响:与对照组相比,染氟组大鼠生长板软骨细胞Bmal1蛋白的表达含量下降（P<0.05）。2、氟对小鼠ATDC5细胞增殖和蛋白多糖的影响:低剂量氟促进细胞增殖,高剂量10-3M NaF抑制细胞增殖（P<0.05）,10-3M NaF抑制软骨细胞蛋白多糖的合成（P<0.05）。3、氟对小鼠ATDC5细胞分化标志因子的影响:在ATDC5细胞处于增殖和前肥大阶段,氟抑制转录因子Sox9的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,抑制增殖标志因子Col2a1的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）;在ATDC5细胞处于肥大阶段,氟促进转录因子Sox9的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）以阻碍细胞的进一步分化,抑制分化标志因子Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）。与阿利新蓝染色染色结果一致,氟抑制Aggrecan的mRNA表达（P<0.05）。4、氟对小鼠ATDC5细胞中Bmal1和生物钟信号通路的影响:氟抑制核心时钟因子Bmal的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,抑制Clock的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,促进下游Per1和Cry1的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）。5、氟对小鼠ATDC5细胞的昼夜节律的影响:与对照组相比,染氟组分化标志因子（Col2a1、Ihh、Col10a1）和生物钟信号通路相关因子（Bmal1、Clock、Per1、Cry1）的蛋白节律性均受到抑制,且氟抑制Col2a1、Ihh、Col10a1、Bmal1和Clock的蛋白表达,促进Per1、Cry1的蛋白表达。6、过表达Bmal1对染氟ATDC5细胞的细胞分化的影响:过表达Bmal1完全扭转了氟对ATDC5细胞的Sox9、Col2a1、Aggrecan、Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白水平的抑制作用,促进了软骨细胞的分化。结论:1、氟抑制ATDC5细胞的增殖,延迟ATDC5细胞的分化。2、氟抑制生物钟正反馈回路因子的表达,促进生物钟负反馈回路因子的表达,扰乱ATDC5细胞的昼夜节律。3、氟可通过下调转录因子Bmal1、干扰生物钟信号通路,抑制ATDC5细胞的软骨形成分化。