小G蛋白(Small GTP-binding proteins)作为重要的分子开关在植物细胞信号转导以及生长发育过程中发挥着重要作用。课题组前期利用抑制差减杂交分离大粒普通玉米自交系丹232和小粒爆裂玉米自交系N04早期胚乳发育差异表达基因,克隆到小G蛋白基因ZmArf2,转化拟南芥得到过表达纯合株系发现该基因能使植株营养器官和种子增大(Wang et al.,2016)。为解析ZmArf2基因调控植物生长发育的分子机制,本研究通过数字基因表达谱测序技术分析超表达ZmArf2转基因拟南芥的差异表达基因并加以验证,并通过酵母双杂交对筛选到的4个ZmArf2互作蛋白进行回转验证及Pull-down体外验证。本研究得到的主要结果如下:1.数字基因表达谱分析生长5周的超表达ZmArf2转基因及野生型拟南芥植株,共鉴定到26597个表达基因,显著差异表达基因745个,包括上调表达基因224个和下调表达基因521个。对随机选取的8个DEGs进行实时荧光定量,结果表明表达谱数据可靠。富集最显著的GO分类条目中差异表达基因主要参与的细胞成分包括叶绿体、类囊体以及光合系统,分子功能主要包括氧化还原酶活性、电子载体活性和四吡咯结合,涉及的生物过程涉及代谢物合成和能量传递,这些富集到的GO功能分类都和植物生长发育密切相关,其中12个差异表达基因功能涉及果实和种子的发育,这表明超表达外源基因ZmArf2影响拟南芥生长发育进程。Pathway注释的差异表达基因(DEGs)有507个,共涉及105条Pathway,富集最显著的前5个条目分别是光合作用、代谢途径、氧化磷酸化、次生代谢物的生物合成、核糖体形成,其中几个差异显著的DEGs功能注释中大多与ABA响应有关。ABA激素处理实验表明,ZmArf2在一定程度上能够抵御ABA的胁迫。2.构建ZmArf2基因的酵母表达载体pGBKT7-ZmArf2与4个互作基因Zm ISP1(NM＿001112091.1)、Zm MT2A(EU954845.1)、Zmvps29(NM＿001154277)和ZmSYS1(NM＿001138217)的酵母表达载体pGADT7-Zm ISP1、pGADT7-Zm MT2A、pGADT7-Zmvps29、pGADT7-ZmSYS1。通过酵母双杂回转验证,将诱饵蛋白与互作蛋白共同转化酵母细胞,结果在二缺培养基上正常生长,在四缺+X+A培养基上正常生长且菌落变蓝。证明在酵母双杂系统中ZmArf2蛋白与Zm ISP1、Zm MT2A、Zmvps29和ZmSYS1蛋白之间存在相互作用关系。3.构建带有GST标签的蛋白表达载体pGEX4T-1-ZmArf2,带有His标签的蛋白表达载体p ET28a-Zm ISP1、p ET28a-Zmvps29和p ET28a-ZmSYS1,通过转化大肠杆菌BL21感受态,加入IPTG在一定的温度和时间等条件下进行诱导,这些蛋白均可在原核系统中表达。进而通过GST Pull-down,western-blot分析后,发现ZmArf2蛋白与Zm ISP1、Zmvps29和ZmSYS1蛋白之间存在真实互作关系。4.本研究选取了一个SYS1家族蛋白基因ZmSYS1进行拟南芥转化。利用实验室保存的转ZmArf2基因拟南芥纯合株系和哥伦比亚野生型拟南芥株系,通过构建过表达载体p CMBIA3301-ZmSYS1转化农杆菌GV3101,使用花粉管通道法将其分别转化野生型拟南芥和转ZmArf2基因拟南芥,得到阳性植株,初步表型鉴定发现ZmArf2基因和互作基因ZmSYS1共同影响拟南芥花期,ZmSYS1可以加强ZmArf2在拟南芥根部的表达。