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背景:巨噬细胞（macrophage,m（?））属于单核吞噬系统,在清除病原体异物、介导炎症反应、组织再生修复等方面发挥着重要作用。根据所处的具体微环境不同,巨噬细胞呈现出显著异质性。在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激下巨噬细胞向M1型极化,称为经典激活型巨噬细胞,能分泌IL-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子（TNF-α）、ROS等炎症因子,参与Th1型细胞免疫。在白介素-4（interleukin-4,IL-4）刺激下,巨噬细胞向M2型极化,称为替代激活型巨噬细胞,表达甘露糖受体（CD206）、精氨酸酶-1（Arg-1）、IL-10等抗炎分子,参与组织修复。巨噬细胞本身具有高度可塑的特征,已民极化的巨噬细胞可以在局部微环境调节下发生表型的转换。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是一种磷酸化的骨基质糖蛋白,广泛表达于各种免疫细胞如T细胞、巨噬细胞及树突状细胞等。作为潜在的免疫调节因子,OPN被认为是一种介导细胞免疫的Th1型促炎因子,可调节细胞粘附、迁移、生存,参与肉芽组织形成等。近年来的大量研究发现,OPN在抗炎机制中也有重要作用,可能兼具促炎和抗炎多重功能。异物巨细胞（foreign body giant cells,FBGCs）是由多个巨噬细胞相互融合而成的多核巨细胞,其主要功能是吞噬隔离病原体和外来异物。以往认为FBGCs在种植体周围组织的长期存在是导致宿主异物排斥反应的主要原因,但越来越多的证据表明,FBGCs在生物材料引起机体异物反应中的确切作用还需要深入研究。有报道认为,FBGCs也有异质性,具备M1/M2等极化表型特征,FBGCs的存在对种植体-骨界面的骨结合可能具有不可或缺的作用。目的:第一部分:巨噬细胞极化实验选取小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,添加外源性OPN,并将OPN与极化诱导剂（LPS、IL-4）联合培养,qRT-PCR、Western blot、ELISA、免疫荧光检测相应极化基因标志物的表达情况,探索OPN对巨噬细胞极化的影响。第二部分:巨噬细胞融合实验选取小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,添加外源性OPN,并将OPN与融合诱导剂IL-4联合培养4-5天,MGG染色观察FBGCs形成,qRT-PCR、Western blot检测融合基因表达情况,探索OPN对巨噬细胞融合形成FBGCs的影响。方法:第一部分:探索外源性OPN对巨噬细胞极化的影响体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,按照如下分组实验,对照组不加任何因子:①OPN浓度梯度实验:设定对照组,实验组加入不同浓度OPN（0.1,0.5,1μg/ml）。②M1型极化实验:设定对照组,LPS（100ng/ml）组,OPN（1μg/ml）组,LPS+OPN组。③M2型极化实验:设定对照组,IL-4（20ng/ml）组,OPN（1μg/ml）组,IL-4+OPN 组。培养 24h 后,qRT-PCR 检测 M1 型基因 iNOS、TNF-α、IL-1β 及 M2 型基因 CD206、Arg-1、IL-10 的 mRNA 表达;Western blot 检测 iNOS、Arg-1的蛋白表达;ELISA检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度;免疫荧光检测iNOS、CD206的表达。第二部分:探索外源性OPN对巨噬细胞融合形成FBGCs的影响体外培养RAW264.7细胞,按以下分组实验:设定对照组,不同浓度OPN（0.1,0.5,1μg/ml）组,IL-4（20ng/ml）组,IL-4+OPN 组。培养细胞 4-5 天后,MGG 染色观察FBGCs形成。培养2天后,qRT-PCR检测融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2的mRNA表达;Western blot检测ATP6V0D2的蛋白表达。结果:第一部分:巨噬细胞极化实验结果1.qRT-PCR显示:与对照组比较,OPN组的M1型基因iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达显著上调（P<0.05）,LPS+OPN组上调程度最高（P<0.05）;OPN组的M2 型基因 CD206、Arg-1、IL-10 的 mRNA 表达也显著上调（P<0.05）,IL-4+OPN组上调程度最高（P<0.05）。2.Western blot显示:与对照组比较,OPN组的iNOS、Arg-1蛋白表达均增强;LPS+OPN组的iNOS蛋白表达最强,IL-4+OPN组的Arg-1蛋白表达最强。3.ELISA显示:OPN刺激细胞后,上清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度均显著升高（P<0.05）;LPS+OPN组上清中炎症因子TNF-α、IL-1β浓度最高（P<0.05）,IL-4+OPN组上清中抗炎因子IL-10浓度最高（P<0.05）。4.免疫荧光显示:与对照组比较,OPN组的iNOS、CD206表达均增强;LPS+OPN组的iNOS表达量最高,IL-4+OPN组的CD206表达量最高。第二部分:巨噬细胞融合实验结果在IL-4（20ng/ml）诱导下体外培养RAW264.7细胞4-5天,MGG染色可观察到多核的FBGCs形成。单独OPN刺激细胞后,也有部分FBGCs形成。IL-4+OPN联合培养组的FBGCs数量最多。qRT-PCR检测显示:与对照组比较,OPN组的融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2表达显著上调（P<0.05）,IL-4+OPN组上调程度最高（P<0.05）。Western blot检测显示:OPN组的ATP6V0D2蛋白表达增强,IL-4+OPN组表达最强。结论:实验结果显示,在没有极化诱导剂（LPS、IL-4）时,OPN本身可促进M1型及M2型分子的表达,并在一定浓度范围内（0.1-1μg/ml）呈浓度依赖关系。进一步研究发现,OPN可与LPS和IL-4诱导剂呈协同促进作用。这提示OPN作为巨噬细胞的活化因子,可能激活静止的巨噬细胞,刺激其产生介于M1-M2型之间的混合表型,分泌一系列细胞因子。根据所处的微环境不同,OPN可能具有促炎和抗炎双向作用。另外也发现,OPN本身可诱导巨噬细胞融合形成多核的FBGCs,并与IL-4有协同促进作用,相应融合基因DC-STAMP、ATP6V0D2表达上调。