胃癌是发展中国家癌症相关死亡的首要原因之一。胃癌患者的预后很差,五年生存率低于30%。胃癌发生发展及转归与胃癌的免疫抑制性微环境密切相关。肿瘤微环境由肿瘤细胞及各种基质细胞共同组成,其中包括大量免疫细胞,这些免疫细胞构成了肿瘤的免疫微环境。中性粒细胞在实体瘤中大量浸润,在不同肿瘤微环境中,其表现为不同的表型,发挥不同的功能。但是,目前还不清楚胃癌微环境中的中性粒细胞的表型、功能及其临床意义。研究目的1.明确中性粒细胞在胃癌中的分布和表型特征;2.探讨胃癌微环境对中性粒细胞的调控及其机制;3.明确中性粒细胞在胃癌中的功能及作用机制;4.从体内对中性粒细胞在胃癌中的功能及作用机制进行验证,阐明胃癌激活中性粒细胞的临床意义。研究方法1.中性粒细胞在胃癌中的分布和表型特征在重庆西南医院普通外科收集胃癌病人新鲜外周血和不同类型胃组织标本(包括胃癌组织、癌旁组织及非肿瘤正常胃组织)。流式细胞术和免疫组织化学染色检测中性粒细胞的分布情况;流式细胞术检测中性粒细胞表型。2.胃癌微环境对中性粒细胞的调控及其调控机制分选健康成人外周血中性粒细胞,用20%、40%、50%或80%胃癌组织培养上清(TTCS)或50%正常胃组织培养上清(NTCS)刺激16h后,流式细胞术检测中性粒细胞的凋亡情况。分选健康成人外周血中性粒细胞,用TTCS或NTCS刺激外周血中性粒细胞12h后,收集细胞用于流式染色,分析条件性中性粒细胞的表型。基因芯片检测胃癌组织中促炎因子表达情况。分选健康成人外周血中性粒细胞,用不同重组人细胞因子(GM-CSF,M-CSF,G-CSF,IFN-γ,TGF-β,IL-1β,IL-6,IL-17A,IL-23,IL-22,IL-10)刺激外周血中性粒细胞12h后,收集细胞用于流式染色,分析条件性中性粒细胞的表型。提取胃癌组织和正常胃组织蛋白,收集TTCS和NTCS,用ELISA试剂盒检测其中的GM-CSF的浓度。取胃癌标本做石蜡切片,用免疫荧光双染技术检测GM-CSF与EP-CAM的共表达情况。分选健康成人外周血中性粒细胞,分别用不同信号通路阻断剂(AG490、FLLL32、BAY11-7082、SP600125、SB203580和Wortmannin)作用2h后,分别加入50%TTCS、50%NTCS或重组人GM-CSF,刺激12后,收集细胞用于流式染色,分析条件性中性粒细胞的表型。3.中性粒细胞在胃癌中的功能及作用机制流式分选胃癌组织及正常胃组织中的中性粒细胞,在加或不加anti-PD-L1抗体的条件下,按1:2的比例与CFSE标记的CD3+T细胞共培养5d后,收集细胞用于流式检测,检测CD3+T细胞的增殖及IFN-γ的产生。分选外周血中性粒细胞,用50%TTCS刺激中性粒细胞12h后获得条件性中性粒细胞,在加或不加anti-PD-L1抗体的条件下,按1:2的比例分别与CFSE标记的同种或异种CD3+T细胞、PD-1+T细胞或PD-1-T细胞共培养5d后,收集细胞用于流式检测,检测CD3+T细胞的增殖及IFN-γ的产生。4.中性粒细胞的免疫抑制作用验证及临床意义研究给NOD/SCID小鼠皮下注射106个SGC-7901细胞,构建胃癌移植瘤模型。分选外周血中性粒细胞,用50%TTCS或1640培养基刺激12h后,在加或不加anti-PD-L1抗体或control Ig G抗体的条件下,与CD3+T细胞按1:1的比例共培养24h后,收集细胞,在移植瘤构建第10天时,通过腹腔注射途径将细胞注射入小鼠体内。每两天用游标卡尺测量移植瘤大小,直至第24d。杀死小鼠,取出移植瘤,测量大小并拍照,将移植瘤用多聚甲醛固定后,制成石蜡包埋组织切片用于免疫组化染色;取出小鼠脾脏,匀浆后收集细胞用于流式染色,检测IFN-γ+CD3+T细胞应答情况。分析胃癌组织浸润中性粒细胞与临床指标的相关性;分析中性粒细胞及PD-L1+中性粒细胞与病人总体生存率的相关性。研究结果1.中性粒细胞在胃癌中的分布和表型特征;1.1胃癌患者外周血中性粒细胞百分率显著高于健康成人。就胃癌患者本身,胃癌组织中性粒细胞百分率和绝对数(以每1,000,000个总细胞中中性粒细胞的绝对数量来统计)均显著高于其他组织。免疫组织化学染色结果也表明,中性粒细胞在胃癌组织中浸润增加。1.2与癌旁组织或非肿瘤正常胃组织相比,胃癌组织浸润的中性粒细胞高表达中性粒细胞激活相关分子CD54及免疫抑制性分子PD-L1。胃癌组织中浸润的CD54+中性粒细胞百分率与PD-L1+中性粒细胞百分率呈显著正相关;胃癌组织中浸润的CD54+中性粒细胞的绝对数与PD-L1+中性粒细胞绝对数呈显著正相关。流式染色结果表明胃癌组织内浸润的中性粒细胞共表达CD54和PD-L1分子,提示胃癌组织内浸润的中性粒细胞的表型为激活/抑制双重表型。2.胃癌微环境对中性粒细胞的调控及其调控机制2.1与NTCS及1640培养基(Medium)相比,TTCS可以显著抑制中性粒细胞的凋亡,说明胃癌微环境可能通过延长中性粒细胞寿命而使中性粒细胞浸润增加。2.2与NTCS及Medium相比,TTCS可以显著上调中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达,说明胃癌微环境对于激活中性粒细胞并维持其免疫抑制表型起着重要作用。2.3肿瘤组织标本基因芯片分析结果显示:TGF-β,M-CSF,G-CSF,IL-1β,IL-17A,IL-6,IL-23,IL-10,GM-CSF,IFN-γ,IL-22等细胞因子在肿瘤组织中高表达。用这些重组细胞因子刺激外周血中性粒细胞,发现:GM-CSF可以显著上调中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达。此外,阻断TTCS中的GM-CSF可以显著抑制中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达,而在NTCS中加入重组人GM-CSF后,可以显著上调中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达。用ELISA试剂盒检测胃癌组织、非肿瘤正常胃组织、TTCS及NTCS中的GM-CSF,结果发现胃癌组织中的GM-CSF表达显著高于非肿瘤正常胃组织,TTCS中的GM-CSF浓度显著高于NTCS。同时胃癌组织中的GM-CSF浓度与CD54+中性粒细胞及PD-L1+中性粒细胞浸润数量呈正相关。免疫荧光双染结果显示GM-CSF来源于胃癌细胞。以上结果表明胃癌上皮细胞来源的GM-CSF在激活中性粒细胞并维持其免疫抑制表型中起着关键作用。2.4阻断JAK或STAT3信号通路后,TTCS或GM-CSF均不能上调中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达;WB结果显示:TTCS可以诱导中性粒细胞中STAT3信号通路的磷酸化,而阻断TTCS中的GM-CSF后,STAT3的磷酸化受到抑制。说明GM-CSF上调中性粒细胞表面CD54及PD-L1的表达依赖于JAK-STAT3信号通路。3.中性粒细胞在胃癌中的功能及作用机制3.1与非肿瘤正常胃组织浸润的中性粒细胞相比,胃癌组织浸润的中性粒细胞可以显著抑制CD3+T细胞的增殖及INFγ的产生,该抑制作用依赖于PD-L1通路。对胃癌标本的流式分析结果显示胃癌微环境中浸润的中性粒细胞百分率和T细胞百分率呈负相关,胃癌微环境中浸润的中性粒细胞绝对数和T细胞绝对数也呈负相关。3.2条件性中性粒细胞可以显著抑制同种或异种CD3+T细胞的增殖及INFγ的产生,该抑制作用依赖于PD-L1通路。3.3条件性中性粒细胞可以显著抑制同种或异种PD-1+CD3+T细胞的增殖及INFγ的产生,该抑制作用依赖于PD-L1通路;而对PD-1-CD3+T细胞没有抑制作用。说明条件性中性粒细胞对T细胞的抑制作用是依赖PD-1-PD-L1通路的。胃癌标本流式统计结果显示胃癌微环境中的PD-L1+中性粒细胞与PD-1+T细胞在百分率和绝对数上呈负相关。4.中性粒细胞的免疫抑制作用验证及临床意义研究4.1与Medium组小鼠(注射PBS)相比,T cells+N组小鼠(注射经正常中性粒细胞(N)处理的T细胞)的移植瘤体积明显减小,说明正常的T细胞应答可以显著抑制移植瘤生长;而与T cells+N组小鼠相比,T cells+TCN组小鼠(注射经条件性中性粒细胞(TCN)处理的T细胞)的移植瘤体积明显增加,说明TCN抑制了T细胞反应,从而解除了T细胞应答对肿瘤生长的抑制作用;与T cells+TCN组小鼠或T cells+TCN+control Ig G组(共培养体系中加入control Ig G抗体)相比,T cells+TCN+anti-PD-L1组小鼠(共培养体系中加入anti-PD-L1抗体)的移植瘤体积明显缩小(P<0.05),说明TCN对T细胞应答的抑制作用是通过免疫抑制性分子PD-L1起作用的。4.2检测小鼠脾脏中IFN-γ+T细胞的应答情况,发现:与T cells+TCN组或T cells+TCN+control Ig G处理组相比,T cells+TCN+anti-PD-L1组小鼠脾脏内IFN-γ+T细胞的比例显著增加,说明TCN对T细胞应答的抑制作用是通过PD-L1实现的。4.3免疫组化染色结果显示:与T cells+TCN组或T cells+TCN+control Ig G处理组相比,T cells+TCN+anti-PD-L1组小鼠移植瘤细胞的增殖明显受到抑制,移植瘤内浸润的CD3+T细胞明显增加。说明TCN通过PD-L1抑制CD3+T细胞增殖,从而使移植瘤内CD3+T细胞浸润减少,促进移植瘤进展。4.4临床相关性分析显示,增高的中性粒细胞百分率与淋巴管侵袭的累及、肿瘤大小的增长和肿瘤侵袭(T)分期的进展相关。根据胃癌组织浸润中性粒细胞的百分率中位数(5.24%)将病人分为中性粒细胞高浸润组(≥5.24%)和中性粒细胞低浸润组(<5.24%),统计病人44个月的总体生存率发现,中性粒细胞高浸润组病人的总体生存率显著低于浸润低组。用胃癌组织浸润中性粒细胞绝对数对病人分组也得到同样的结论。此外,根据胃癌组织浸润PD-L1+中性粒细胞的百分率中位数(24%)将病人分为PD-L1+中性粒细胞高浸润组(≥24%)和PD-L1+中性粒细胞低浸润组(<24%),统计病人20个月的总体生存率发现,PD-L1+中性粒细胞高浸润组病人的总体生存率显著低于浸润低组。用胃癌组织浸润PD-L1+中性粒细胞绝对数对病人分组也得到同样的结论。结论1.胃癌微环境中有大量中性粒细胞浸润,其表现为激活/抑制双重表型。2.胃癌微环境能够延长中性粒细胞的寿命;胃癌细胞来源的GM-CSF通过JAK-STAT3信号通路激活中性粒细胞并上调其表面PD-L1的表达。3.胃癌激活的中性粒细胞通过PD-L1-PD-1通路抑制T细胞的功能,从而抑制胃癌免疫并促进胃癌进展。4.中性粒细胞百分比和数量与胃癌进展密切相关,并且可以预测病人的总体生存率。5.PD-L1+中性粒细胞的百分比和数量与胃癌进展密切相关,并且可以预测病人的总体生存率。意义本文在胃癌中发现了一群具有激活/抑制双重表型的中性粒细胞。PD-L1+中性粒细胞可以作为新的检测肿瘤微环境的指标,以其应答高低来判断肿瘤微环境的状态,进而为肿瘤治疗的术前调节、方案选择和术后治疗提供指导;在胃癌免疫治疗中,既可以选择免疫抑制性分子PD-L1为直接靶点,也可选择以其“调控者”GM-CSF为间接靶点,为肿瘤免疫治疗提供了新思路。