论文部分内容阅读
研究目的自从第一位艾滋病患者发现以来,艾滋病已经对全世界人类的生命健康造成了重大威胁。虽然高效的联合抗逆转录病毒疗法(cART)能够有效地控制病毒的复制,降低了艾滋病患者的发病率以及死亡率,延长其生存时间,但是长期接受联合抗逆转录病毒疗法的AIDS病患者体内潜伏的HIV病毒会在停止服药后迅速反弹。与此同时,HIV基因极易产生突变从而导致耐药株的产生,使得目前药物治疗效果变差,必须不断开发新药进行治疗。此外,由于药物自身存在的毒副作用以及病毒感染导致的免疫细胞的耗破等,我们迫切需要探索更安全有效的抗病毒治疗方法。近年来,CAR-T细胞疗法在B淋巴瘤和白血病的治疗中获得了巨大的成功。该疗法具备高亲和力、TCR(T细胞受体)独立以及MHC非限制的特点。嵌合抗原受体是通过融合胞外的靶向识别结合抗原的结构域,跨膜结构域以及胞内的T细胞激活信号结构域构成的。采用基因工程技术向效应T细胞中导入相应基因,该基因将在T细胞内表达,由此,该细胞具备了抗原特异性识别的能力。通过患者自体免疫细胞基因改造和再回输,从而特异性地杀死体内存在的相应的肿瘤细胞。已有一些研究证明,可以采用将天然的CD4分子中的抗原识别结合区或者是HIV特异性单链抗体的可变区(scFv)与CD8+T细胞的T细胞的活化区融合,构建特异性的抗HIV CAR-T细胞。这一细胞因相关分子的表达具有特异性地杀死表达HIV包膜蛋白的细胞的能力。嵌合抗原受体T细胞疗法在HIV治疗领域展现出广泛前景,表现出巨大潜力。本实验室前期通过噬菌体抗体筛选技术从我国流行株HIV感染者体内分离了两个单克隆HIV广谱中和抗体:A16和Y498(专利号:ZL 201310154423.4、ZL201110078167.6)。前期SPR实验表明,这两个抗体对HIV病毒的亲和力均高于VRC01,更适用于进行CAR-T构建。因此,在这项研究中,我们将以VRC01为对照,使用A16和Y498来进行CAR-T构建,并评估其杀伤效果。研究方法在本文中,我们使用来源于三个识别CD4结合位点的HIV广谱中和抗体(VRC01、A16和Y498)的scFv基序分别与第三代CAR分子模型中的胞内及跨膜结构域基序进行融合,再将其构建于第三代慢病毒载体,随后验证蛋白的表达并进行慢病毒包装,并通过慢病毒转导原代CD8+T细胞的方式完成三种CAR-T细胞的构建。通过将三种CAR-T细胞分别与表达HIV标准株HXB2和JRFL包膜蛋白的细胞系共培养,验证其杀伤活性。研究结果本研究中,成功构建了三种CAR分子并通过免疫荧光及Western Blot实验验证了三种CAR分子的蛋白表达,通过不断调整,逐步提高了慢病毒滴度,确定病毒活力,并成功转导CD8+T细胞。经过不同实验条件的探究进行了对稳定表达HIV包膜蛋白细胞系的杀伤等体外实验,结果表明基于A16和Y498的scFv构建的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果基本与VRC01相当。研究讨论我们的研究结果表明,基于本实验室筛选所得的广谱中和抗体A16和Y498的scFv基序构建CAR-T细胞具有极强的可行性,具有进一步研究的意义。我们进一步推测,两种CAR-T细胞同样能与已报道的基于VRC01的scFv构建的CAR-T细胞一样清除接受cART治疗的HIV感染者体内被重激活的潜伏感染储存库,值得进一步研究及优化。