本文分为以下两个部分进行探讨：　　第一部分 tmTNF-α诱导乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素耐受的分子机制　　乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤疾病，化疗抵抗常导致肿瘤治疗失败。TNF-α有跨膜型TNF-α（transmembrane tumor necrosis factor,tmTNF-α）和分泌型TNF-α（secrettumor necrosis factor,sTNF-α）两种生物活性形式。tmTNF-α首先表达于细胞膜，被金属蛋白酶TNF-α转换酶剪切后，释放sTNF-α，同时在细胞表面留下其N-末端片段（N-terminal truncated fragment,NTF）。我们前期工作证实，近70%乳腺癌病人的肿瘤细胞表达tmTNF-α，敲低乳腺癌病人原代肿瘤细胞的tmTNF-α可逆转肿瘤细胞对阿霉素的抵抗。但是，其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨并阐明tmTNF-α诱导乳腺癌细胞对阿霉素耐药的分子机制和信号通路，为靶向tmTNF-α治疗乳腺癌提供新的思路。主要结果如下：　　1.tmTNF-α导致乳腺癌细胞耐药：用MTT试验证实高表达tmTNF-α的MDA-MB-231乳腺癌细胞对阿霉素杀伤效应抵抗，稳转shRNA敲低tmTNF-α表达则可逆转该细胞株对阿霉素的敏感性。反之，不表达tmTNF-α的MCF-7乳腺癌细胞对阿霉素杀伤效应敏感，当过表达tmTNF-α的NTF可导致MCF-7细胞从敏感株变为耐受株，提示tmTNF-α通过反向信号诱导乳腺癌细胞耐药。　　2.tmTNF-α通过激活ERK信号通路导致乳腺癌细胞对阿霉素耐药：用Western blot证实tmTNF-α以及过表达NTF均可促进ERK1/2磷酸化，敲低tmTNF-α则明显抑制ERK1/2的磷酸化。用ERK抑制剂PD98059阻断ERK信号通路，可明显阻断tmTNF-α以及过表达NTF导致的阿霉素耐药，增加肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。　　3.GST-π参与tmTNF-α诱导乳腺癌对阿霉素耐药：用Realtime PCR证实tmTNF-α或过表达NTF均可促进GST-π基因转录，敲低tmTNF-α则明显抑制该分子的表达。用流式细胞术证实高表达tmTNF-α的MDA-MB-231细胞和过表达NTF的MCF-7细胞胞内阿霉素荧光强度明显减低，并抵抗阿霉素诱导的凋亡；用siRNA敲低GST-π，可明显增加高表达tmTNF-α或NTF肿瘤细胞内阿霉素含量，并促进这些肿瘤细胞对阿霉素杀伤的敏感性。提示tmTNF-α诱导的GST-π通过降解胞内阿霉素导致耐药。　　4.GST-π/ERK正反馈促进tmTNF-α诱导的耐药：用ERK抑制剂PD98059和SCH772984可在mRNA和蛋白水平上抑制tmTNF-α/NTF诱导的GST-π表达,提示ERK信号通路可介导tmTNF-α诱导GST-π表达；反之，在阿霉素存在的情况下，敲低GST-π可明显抑制tmTNF-α或NTF诱导的ERK1/2磷酸化。提示tmTNF-αtmTNF-α通过ERK信号通路诱导GST-π表达，而GST-π又可进一步促进ERK的活化，形成正性反馈，促进肿瘤细胞耐药。　　5.NF-κB参与tmTNF-α诱导的耐药：Western blot结果显示高表达tmTNF-α或NTF导致肿瘤细胞NF-κB持续性活化，上调抗凋亡分子，而敲低tmTNF-α则抑制NF-κB，并下调抗凋亡分子。用NF-κB抑制剂可逆转tmTNF-α以及NTF诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞对阿霉素的抵抗。提示tmTNF-α可通过其反向信号激活NF-κB，上调抗凋亡分子，导致乳腺癌耐药。　　6.tmTNF-α在体内促进乳腺癌细胞对阿霉素耐受：给雌性裸鼠乳房脂肪垫接种稳转Control shRNA或tmTNF-αshRNA的MDA-MB-231细胞，当肿瘤生长至100mm3，用阿霉素治疗三周，结果显示敲低tmTNF-α可明显提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，小鼠肿瘤生长缓慢，生存期明显延长。与体外结果一致，敲低tmTNF-α可明显抑制ERK与NF-κB信号通路，下调GST-π与抗凋亡分子的表达。　　我们的结果提示tmTNF-α-ERK-GST-π轴以及tmTNF-α-NF-κB信号通路在tmTNF-α阳性乳腺癌细胞耐药中发挥重要作用。联合应用tmTNF-α单克隆抗体与阿霉素等化疗药将有益于治疗阿霉素耐药的乳腺癌患者。　　第二部分 tmTNF-α以及流感病毒双特异性CAR-T细胞对乳腺癌的杀伤作用　　CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤中取得极大成功。由于实体瘤不同于血液系统肿瘤，CAR-T的治疗效果并不令人满意。除此之外，CAR-T细胞在体内不能持续存在也是肿瘤复发的原因之一。本室前期工作中，制备了针对tmTNF-α单克隆抗体，可通过ADCC和CDC特异性杀伤高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞，提示tmTNF-α可作为CAR-T细胞治疗乳腺癌的有效靶点。　　本研究旨以tmTNF-α-scFv为基础构建靶向tmTNF-α的第二代（tmTNF-α-scFv-4-1BB）嵌合型抗原受体，利用逆转录病毒将CAR转染至流感病毒特异性T记忆细胞，并观察CAR-T对tmTNF-α阳性乳腺癌细胞和转染流感病毒HA的乳腺癌细胞的杀伤作用。期望1次性CAR-T细胞治疗后，可用流感疫苗刺激体内CAR-T细胞增殖，以最终清除肿瘤细胞。其主要结果如下：　　1.用基因工程技术将抗原识别单位tmTNF-α-scFv、CD8?链跨膜段和信号单位即CD3ζ链和4-1BB胞内段重组，成功构建了携带靶向tmTNF-α的嵌合型抗原受体的逆转录病毒，并稳转包装细胞，获得高滴度逆转录病毒颗粒。　　2.成功构建稳转tmTNF-α和H1N1-HA的4T-1细胞株，构建稳转tmTNF-α的4T1-LUC细胞株，流式细胞术检测tmTNF-α和H1N1-HA的表达，作为CAR-T细胞的靶细胞。　　3.将tmTNF-α特异性CAR通过逆转录病毒转入小鼠原代T细胞，可特异性杀伤高表达tmTNF-α的4T-1乳腺癌细胞。　　4.通过流感疫苗免疫小鼠45天，获得脾脏T细胞，并在体外联合应用流感疫苗和CD3/CD28抗体刺激小鼠，最大程度上获得流感病毒特异性记忆T细胞，转染tmTNF-α特异性CAR，获得流感病毒-tmTNF-α双特异性CAR-T细胞。　　5.流感病毒-tmTNF-α双特异性CAR-T细胞在体外可成功识别和杀伤tmTNF-α（+）或H1N1-HA（+）的乳腺癌细胞，促进杀伤效应分子CD107a、Perforin、Granzyme B、Fas和FasL的表达。　　本研究成功构建流感病毒-tmTNF-α双特异性CAR-T细胞，在体外可有效杀伤tmTNF-α（+）或H1N1-HA（+）的乳腺癌细胞，为进一步探讨流感病毒-tmTNF-α双特异性CAR-T细胞的体内杀瘤效应，疫苗接种诱导体内扩增CAR-T以及清除肿瘤细胞效应奠定基础。