论文部分内容阅读
纤维素(Cellulose)是地球上最丰富的有机物质，它是光合作用最主要的产物，同时也是最丰富的可再生资源，地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。但纤维素的利用目前尚未完全开发，随着地球石化能源短缺和枯竭的日趋严峻，人类把眼光转向了对纤维素的利用，利用纤维素酶将纤维素降解为可发酵的单糖，进而发酵生产乙醇。然而目前发现的纤维素酶都存在活力低和反应速度慢的缺点，因此寻找新的或者通过改造现有的纤维素酶基因获得活力更高纤维素酶是解决纤维素开发利用的关键问题。
本研究提取了台湾家白蚁总RNA通过RT-PCR扩增出白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因，并分别构建了表达内切-β-1,4-葡聚糖酶的大肠杆菌和酿酒酵母表达载体。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化，CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6.5；内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0.071mg/ml*min，Km值为80.2712mg/ml，比活力为130544U/mg。利用定点突变对白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶基因进行改造，首先是借助计算机根据白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶的同源建模三维结构信息，利用ProSA2003软件根据能量(knowledge-based potentials)最低化原则，计算机辅助设计确定白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶氨基酸饱和突变位点，通过同源建模分析表明53D、56D和411E三个位点都是活性中心位点。利用兼并引物对53，56，411位点的氨基酸分别进行饱和突变，筛选到三个有活力的突变子C53、E53和C56。对突变酶进行酶学性质的研究表明，C53的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为42℃、6.5、37.683 mg/mL、0.0334umol/mL*min、9.912 U/mg；突变酶E53的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为37℃、6.5、93.819mg/mL、0.124umol/mL*min、16.421U/mg；突变酶C56的最适温度、最适pH、米氏常数、Vmax和比活力分别为42℃、8.0、26.809mg/mL、0.0324umol/mL*min、16.470U/mg。