AtRGS1胞吞动态调控JA和PAMPs/DAMPs信号转导的分子细胞学机理研究

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异源三聚体G蛋白是普遍存在于真核细胞中的信号转导分子,由Gα,Gβ和Gγ三个亚基组成。植物中异源三聚体G蛋白参与调控其生长发育、激素和糖信号转导以及抗病反应等多个重要过程。植物细胞通过G蛋白信号调节子(Regulator of G protein signaling,RGS)调控异源三聚体G蛋白的活性,参与多种信号分子调控的植物生长发育和抗性反应过程。为了进一步分析拟南芥中AtRGS1调控G蛋白参与植物激素信号转导和抗病反应的分子细胞学机制,本论文以AtRGS1-YFP和其C端缺失的AtRGS1-ΔCt-YFP转基因植株为主要研究材料,对茉莉素JA和三种不同PAMPs/DAMPs处理后AtRGS1蛋白的胞吞和膜上动态变化进行了深入分析。主要研究结果如下:(1)利用植物生理学手段和qRT-PCR分析了Gα亚基突变体gpa1-4、Gβ亚基突变体agb1-2和双突变体对gpa1-4/agb1-2对JA调控的信号转导的响应情况。研究结果表明,各突变体均对JA抑制的主根伸长、JA诱导的花色素苷积累和抗性基因表达等多方面呈现不同程度的低敏感性;可见,异源三聚体G蛋白参与JA的信号调控。(2)利用激光共聚焦显微镜和VA-TIRFM技术,对JA诱导的AtRGS1的胞吞程度进行了分析。研究结果表明,JA以时间依赖的方式诱导AtRGS1胞吞,并显著缩短其在膜上的驻留时间。激酶抑制剂K252a处理后和C端缺失AtRGS1-ΔCt蛋白的胞吞分析结果说明,JA以磷酸化和C端依赖的方式诱导AtRGS1的胞吞。Western blot检测结果说明,AtRGS1经JA诱导胞吞后未发生明显降解,可能循环上膜重新发挥功能。(3)通过在烟草叶片中瞬时共表达AtRGS1-GFP和AtGPA1-mCherry,并利用FLIM-FRET技术证明:静息状态下,AtRGS1与AtGPA1互作;JA诱导AtRGS1胞吞,进而与AtGPA1解离,游离的异源三聚体G蛋白参与JA信号转导。(4)借助VA-TIRFM和SPT技术分析了JA对AtRGS1在质膜上动力学特征的影响。研究结果表明:JA处理可诱导AtRGS1运动范围和扩散系数的增大;磷酸化状态和蛋白C端均影响JA调控的AtRGS1膜上动态。(5)利用激光共聚焦显微镜和VA-TIRFM技术,对三种不同PAMPs/DAMPs(flg22、chitin和PIP1)诱导的AtRGS1的胞吞程度进行了分析。研究结果表明,PAMPs/DAMPs以时间依赖的方式诱导AtRGS1胞吞,并显著缩短其在膜上的驻留时间。激酶抑制剂K252a处理后和C端缺失AtRGS1-ΔCt蛋白的胞吞分析结果说明,三种不同的PAMPs/DAMPs以磷酸化和C端依赖的方式诱导AtRGS1的胞吞。(6)通过在烟草叶片中瞬时共表达AtRGS1-GFP和AtGPA1-mCherry,并利用FLIM-FRET技术证明:静息状态下,AtRGS1与AtGPA1互作;三种不同的PAMPs/DAMPs均可诱导AtRGS1胞吞,进而与AtGPA1解离,游离的异源三聚体G蛋白参与调控胼胝质沉积等PTI反应。(7)借助VA-TIRFM和SPT技术分析了PAMPs/DAMPs对AtRGS1在质膜上的动力学特征的影响。研究结果表明,三种不同的PAMPs/DAMPs处理均可诱导AtRGS1蛋白运动范围和扩散系数的增大;而相同处理条件下C端缺失的AtRGS1-ΔCt蛋白运动范围增大,但是扩散系数变小。综上所述,JA和三种PAMPs/DAMPs均以磷酸化和C端依赖的方式诱导AtRGS1的胞吞,进而促进其与AtGPA1蛋白解离。游离的异源三聚体G蛋白可参与传递JA信号和调控植物的PTI反应。同时,JA和三种PAMPs/DAMPs也影响AtRGS1蛋白在细胞膜上的动态特征,进而影响其胞吞。本论文揭示了AtRGS1蛋白胞吞和膜上动态调控G蛋白参与JA信号转导的分子细胞学机制,以及不同PAMPs/DAMPs处理后AtRGS1蛋白的胞吞和膜上动态变化特征,为AtRGS1蛋白调控异源三聚体G蛋白进而参与植物激素信号转导和PTI反应过程提供了新的视角。
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