肝癌是当前严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤,占全球新发现癌症的5.4%,每年约有50万人死于肝癌。我国为肝癌的高发地区,肝癌死亡率居于肿瘤死亡率的第二位,年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53%。近几年来,肝癌的发病率和死亡率仍呈不断增高趋势。肝癌的治疗方式主要为手术切除结合放疗及化疗的综合治疗,随着对肝脏生理和解剖结构认识的提高,以及影像和实验室检查技术的进步,不仅肝癌的手术切除率有了很大的提高,而且手术死亡率明显下降。但是,由于起病隐袭,早期症状不明显或不典型,进展迅速,不少患者一经诊断已经达到晚期,往往错失了手术时机。放疗和化疗也没有突破性进展。转移和复发仍是肝癌治疗中无法解决的难题。自上世纪八十年代提出了肿瘤治疗的生物反应修饰理论,从而建立了继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式——生物免疫治疗。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,新的生物治疗药物不断涌现,生物靶向治疗已逐渐成为晚期肝癌病人的新选择、新希望。现阶段,分子靶向治疗和以之为基础的放射免疫靶向治疗在晚期肝癌的治疗上取得了令人鼓舞的良好疗效,逐渐成为晚期肝癌病人的首选治疗手段。下一步肝癌的靶向治疗药物可能将会在以下几个方面取得突破和进展:①新的治疗靶点的发现和多靶点药物的开发;②“双弹头”、“双标记物”的复合型免疫靶向治疗药物的研制;③靶向治疗与其他疗法相结合的综合治疗。本课题所研究的ATPase过去认为是仅仅定位于线粒体内膜上的多亚单位复合酶分子,主要功能为合成ATP,以进行能量代谢。但最新的研究表明ATPase也是存在于细胞表面的受体蛋白。膜表达ATP合成酶不仅具有合成和水解ATP的活性,还承担一系列复杂的生物学功能:调节血清胆固醇水平、影响内皮细胞血管生成并且调节肿瘤细胞胞内pH等。国外对于ATPaseF1的研究正在积极开展中,但ATPaseF1与PLC相关关系的研究报道较为少见。本课题应用制备的ATP合成酶F1结构域单克隆抗体对ATPaseF1在人类肝癌中的表达及其生物学新功能进行了初步研究:首先用EnVision免疫组织化学方法研究了人类肝癌中ATPaseF1的表达情况;然后以牛心线粒体ATPaseF1为抗原,利用杂交瘤技术,制备ATP合成酶F1结构域单克隆抗体,并鉴定其特异性;最后又研究了肝癌HepG2细胞株中ATPaseF1的表达与生物学新功能,旨在为PLC靶向治疗研究提供一个新的方向。目的研究人类肝癌中ATPaseF1的表达情况。制备ATP合成酶F1结构域单克隆抗体,鉴定所得单抗的特异性。详细探讨ATPaseF1在人类肝癌细胞株HepG2中的表达,证实ATPaseF1在HepG2细胞株与肝正常细胞株L-02细胞膜上蛋白表达的差异,以及研究ATPaseF1抗体对HepG2细胞株增殖能力与迁移能力的影响。方法1采用EnVision免疫组织化学方法检测38例PLC配对标本中ATPaseF1表达情况。2提纯牛心肌线粒体F1-ATPase,免疫BALB/C小鼠。通过杂交瘤技术,筛选分泌抗hATPaseF1单抗的杂交瘤细胞株。采用Protein A亲和层析法纯化抗体腹水,SDS-PAGE检测纯化产物纯度。3利用Western blot、细胞免疫荧光、ELISA对所得单抗特异性进行鉴定,单抗亚型检测ELISA试剂盒检测单抗亚型。4运用蔗糖梯度离心法分离出细胞膜结构,继以PIERCE-KIT改良法抽提细胞膜蛋白,抽提产物用COX-1单抗验证以排除线粒体膜蛋白的干扰,再以免疫印迹法(Western blot)检测HepG2细胞株与肝正常细胞株L-02细胞膜上ATPaseF1的蛋白表达差异。5运用细胞免疫荧光及流式细胞技术证实ATPaseF1在HepG2细胞株与肝正常细胞株L-02细胞膜上表达的差异。6利用细胞增殖实验(CCK-8 assay)检测ATPaseF1单抗对HepG2细胞生长增殖的影响。利用划痕愈合试验(Wound-healing assay)和Transwell小室侵袭实验观察ATPaseF1单抗对HepG2细胞迁移能力的影响。结果1 38例PLC肿瘤组织中ATPaseF1的中高度表达总计30例,38例癌旁对照组织的中高度表达总计11例。ATPaseF1蛋白在PLC肿瘤组织的中高度表达率显著高于配对癌旁组织(P<0.01)。2获得纯化的牛心肌线粒体F1-ATPase。筛选出了针对hATPaseF1特异性较强的稳定杂交瘤细胞株5G10。用间接ELISA法测杂交瘤细胞5G10培养上清的抗体滴度为1:104;小鼠腹水的滴度大于1:106。采用Protein A亲和层析法纯化腹水抗体,检测抗体滴度大于1:106,洗脱峰SDS-PAGE鉴定表明纯度大于95%。3用Sigma Immuno TypeTM Kit检测Mab5G10属IgG1型。HepG2细胞全蛋白和提纯的牛心肌线粒体ATPaseF1进行Western blot结果均在约50 kD处有单一条带,与细胞全蛋白其他条带组分无明显交叉反应,故单抗与ATPaseF1特异性结合。A549细胞免疫荧光分析表明,该单抗能识别细胞浆中的ATPaseF1,并且在不透膜细胞染色中有细胞膜特异性结合,因此制备单抗具有与天然抗原结合的活性。ELISA检测证实单抗能与ATPaseF1及ATPaseF1β结合。4抽提出的HepG2细胞株与肝正常细胞株L-02的细胞膜蛋白经Dot-blot检验证实为细胞膜蛋白,排除了线粒体膜蛋白的干扰,免疫印迹法(Western blot)显示HepG2细胞株的胞膜有ATPaseF1的表达,而肝正常细胞株L-02的细胞膜上无ATPaseF1表达。5细胞免疫荧光分析表明ATPaseF1单抗与HepG2细胞膜特异性结合,与L-02细胞膜无特异性结合。流式细胞技术同样证实ATPaseF1单抗与HepG2细胞膜特异性结合,与L-02细胞膜无特异性结合。6细胞增殖计数实验(CCK-8 assay)结果显示:ATPaseF1抗体与对照组比较,对HepG2细胞有增殖抑制作用,结果有统计学差异(P<0.05)。划痕愈合试验(Wound-healing assay)结果显示:ATPaseF1抗体与对照组比较,明显抑制了HepG2细胞的迁移(P<0.01)。Transwell小室侵袭实验结果显示:ATPaseF1抗体与对照组比较,明显抑制了HepG2细胞的侵袭(P<0.01)。结论ATPaseF1在PLC组织中有相对较高的表达水平。成功建立了一株可特异性识别ATPaseF1的单抗。ATPaseF1在HepG2细胞株的细胞膜上有显著表达,而肝正常细胞株L-02细胞膜却无ATPaseF1表达。ATPaseF1单克隆抗体对HepG2细胞的增殖有抑制作用,并可以明显抑制HepG2细胞株的迁移和侵袭。胞膜表达的ATPaseF1作为一种肿瘤相关抗原,可能会为肝癌的靶向治疗提供一个新颖的研究方向。