噬菌体通过其编码的整合酶识别宿主基因组中的attB (attachment site of bacterial)位点,与自身的attP (attachment site of phage)位点形成联会复合体从而发生链交换,将噬菌体基因组整合到宿主染色体,由此进入溶源途径；该过程称为位点特异性重组(site-specific recombination)。研究位点特异性重组分子机制的模型为大肠杆菌噬菌体λ与宿主之间的整合与切离过程。实际上,位点特异性重组涉及范围广泛,存在于各类细胞,彼此发挥着非常不同且十分特殊的作用。一般而言,位点特异性重组过程涉及：噬菌体整合到宿主染色体与环化切离(典型代表为大肠杆菌噬菌体λ和链霉菌噬菌体φC31),一些复合转座子相关共合体(cointegrate)的解离(例如转座子γδ和Tn3)以及某些基因表达的调节(例如沙门氏菌Salmonella typhimurium的鞭毛相转变)。顾名思义,位点特异性重组发生于特定的位点之间,由重组酶催化核心的活性氨基酸向DNA骨架发起攻击并介导双链交换实现重组。近年来,位点特异性重组酶介导的重组反应在遗传工程操作中得到了广泛的应用,由于该反应具有底物专一、快速高效、易于改造应用等特点,获得了极大的关注。做为遗传操作中一种极为有效的工具酶,一些位点特异性重组及其衍生系统已经改造用于各种模式生物研究,其中使用最为广泛的是P1噬菌体的Cre-loxP系统、酵母2μ质粒的Flp-frt系统和链霉菌噬菌体的φC31整合系统。这些系统各有优劣,并在不断的完善改进当中,同时新的系统也在不断的开发及应用(比如Bxb1和Dre整合系统)。随着大量关于位点特异性重组文献的报道涌现,乔治亚大学的Urbanski和Condie开发了用于挖掘位点特异性重组相关文献资料的在线服务器(http://ssrc.genetics.uga.edu/)。该服务器可集中搜索目前近一万篇关于位点特异性重组系统的结构功能研究以及在细菌、果蝇、斑马鱼、干细胞、拟南芥等中的应用研究实例。我们以链霉菌噬菌体φBTl介导位点特异性重组系统为对象,探索其催化反应的分子机制并发展其在合成生物学中的应用潜力。全文分三部分展开：首先我们原核表达纯化了φBT1整合酶,研究其在体外催化位点特异性重组反应的性质,对反应的温度、pH值、离子成分及浓度等条件进行了优化；确定了高效反应发生所需的attB和attP最小位点分别为36 bp和48 bp。结果显示φBT1整合酶能在体外高效催化attB与attP之间的重组反应,同时,我们首次发现大型丝氨酸重组酶能够在缺乏方向控制辅助因子的情况下催化双向的重组反应,即attB和attP之间的整合重组,与attL和attR之间的切离重组。我们进一步研究识别的位点的核心序列和两臂序列在重组过程中的作用,发现核心部分的链交换区域并不影响DNA的识别与联会,其主要作用在于切割末端的配对。同时通过生物化学的手段,研究在大型丝氨酸重组酶催化反应过程中之联会、DNA的切割与重新连接等过程发生的分子机制。与其他大型丝氨酸重组酶不同,我们发现φBT1和φC31整合酶能进行独立于联会复合体形成的单底物的切割,且切割之位点与双底物相同。另外,我们还发现四聚体形态的整合酶能够与attP位点先行结合形成整合体(intasome),再寻找并捕获attB位点实现联会；这一途径为联会形成的可选途径。基于以上生化研究,我们提出了大型丝氨酸重组酶催化位点特异性重组反应的改进模型。由于识别位点的核心双核苷酸并不参与链的识别,因此我们对核心序列进行突变后筛选到16组不兼容底物对；结合φBT1整合酶催化位点特异性重组反应的高效性,我们利用该系统发展了一种体外多片段DNA串联重组拼装的方法(Site-Specific Recombination based Tandem Assembly method, SSRTA)。我们选用抗肿瘤抗生素埃博霉素(epothilones)之生物合成基因簇作为对象,分别成功实现5个和7个DNA片段的体外串联重组拼装,试验之最大串联重组产物为62.4 kb的环状DNA分子。该方法为合成生物学实现相互关联基因的组合与拼装,以及组合模块的删除与替换提供了一种高效精确便捷的方法。综上所述,本研究从链霉菌噬菌体φBT1整合酶出发,建立了高效的体外位点特异性重组系统,并在生化水平上研究其催化反应的分子机制,提出了大型丝氨酸重组酶催化位点特异性重组反应的改进模型；通过不兼容底物对的筛选,发展了高效精确的体外多片段DNA串联重组拼装方法,对该方法的进一步改造和优化,将使其在合成生物学中发挥重要的作用。