肌肉组织由胚胎期中胚层间充质干细胞发育而来的,属于软组织的一种,是动物机体的重要组成部分。骨骼肌是动物体内代谢最旺盛的组织之一,约占动物体重的40%左右。在动物生产中,骨骼肌的发育和蛋白质的沉积直接影响动物肉质性状和产肉量。在人类医学研究中,肌肉疾病的发生导致严重的肌肉萎缩和肌无力,严重影响患者的正常生命活动。成肌细胞的生长发育研究是研究肌肉组织生长发育的基础。因此,对于成肌细胞生长发育过程调控机制的研究无论在动物生产上还是人类疾病的治疗策略优化方面都具有十分重要的意义。肌肉生长发育过程中受到各种调节因子和信号通路的调控。成肌调节因子（myogenic regulatory factors,MRF）是肌生成最重要的调控因子。Myod家族抑制因子（Myod family inhibitor,Mdfi）能够通过屏蔽Myod家族转录因子的核定位信号使其滞留在细胞质中,进而抑制其转录激活。Mdfi在组织发育及器官形成过程中,发挥着广泛且重要调控作用,但是其在肌肉发育过程中的功能及机理的报道尚不多。本研究的主要目的是探究Mdfi在C2C12细胞成肌发育过程中的作用。通过基因组编辑技术CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPRassociated protein 9）系统分别构建Mdfi敲除和过表达的C2C12细胞模型,通过转录组测序技术挖掘Mdfi调节成肌细胞发育的潜在分子机制;结合表型检测和分子生物学试验验证,阐明Mdfi在成肌细胞增殖、分化、迁移等生理过程中的调控作用;通过Mdfi启动子研究揭示Mdfi上游转录因子对Mdfi基因转录表达的调控回路,进一步解析Mdfi在调控C2C12细胞成肌分化过程中的调控机制。研究成果和创新发现,将为成肌细胞发育及骨骼肌肌肉生长发育研究提供新的理论基础。主要研究结果如下:1.通过CRISPR/Cas9系统成功构建Mdfi过表达型和Mdfi敲除型C2C12细胞系。为后续研究提供了重要的研究材料。2.将野生型和Mdfi过表达型C2C12细胞进行转录组测序,测序结果表明,在增殖期,试验组和对照组差异表达基因共有889个,其中上调的差异基因608个,下调差异基因281个;在分化期,试验组和对照组差异表达基因共有1522个,其中上调差异基因434个,下调差异基因1088个。GO分析结果表明,增殖期差异表达基因主要富集在金属离子结合、细胞外基质、细胞内、细胞外空间、钙离子结合、细胞黏附等过程中;分化期差异表达基因主要富集在细胞膜、细胞外泌体、细胞外基质、细胞外空间、细胞膜跨膜结构、细胞黏附、细胞表面、离子转运等过程中;KEGG分析结果表明,在增殖期,差异表达基因富集的信号通路包括Rap1信号通路、细胞骨架肌动蛋白调节通路、心肌细胞肾上腺素信号通路、c AMP信号通路、钙离子信号通路等通路。在分化期,差异表达基因主要富集在细胞黏附、细胞因子与细胞因子互作、钙离子信号通路、c AMP信号通路、Rap1信号通路、细胞黏附分子、细胞外基质受体互作、癌症相关信号通路等信号通路中。由此可见,过表达Mdfi能够通过改变细胞黏附相关信号通路、信号转导等信号通路和细胞内外基质组成等方面影响C2C12细胞的成肌发育过程。3.在C2C12细胞增殖过程中,过表达Mdfi降低Edu阳性细胞数目而敲除Mdfi增加Edu阳性细胞数目;在C2C12细胞增殖过程中,Mdfi能够促进P21的表达,同时抑制Ccnb1和Ccnd1的表达,抑制细胞周期由G1向S和G2期的过渡,使细胞滞留在G1期,进而抑制C2C12细胞的增殖。由此可见,Mdfi能够通过上调P21、同时下调Ccnb1和Ccnd1的表达,阻断C2C12细胞周期从G1向S和G2期的过渡,从而抑制C2C12细胞的增殖。4.在C2C12细胞分化过程中,Myosin免疫荧光染色结果表明,过表达Mdfi能够增加C2C12细胞中Myosin阳性率,敲除Mdfi能够降低C2C12细胞中Myosin阳性率。q RT-PCR结果表明过表达Mdfi能够显著上调Myod、Myogenin、Myf5和Myosin,敲除Mdfi能够显著下调Myod、Myogenin、Myf5和Myosin;Western blot结果表明,过表达Mdfi能够促进Myod、Myogenin和Myosin的蛋白表达,敲除Mdfi能够抑制Myod、Myogenin和Myosin的蛋白表达。由此可见,Mdfi能够通过促进Myod,Myogenin和Myosin的表达,促进C2C12细胞的成肌分化。5.在肌纤维形成过程中过表达Mdfi显著增加Myhc I和Myhc IIa阳性细胞数目,减少Myhc IIb型阳性细胞数目。过表达Mdfi能够增加C2C12细胞中线粒体数目。Mdfi通过促进Myod的表达,Myod能够结合在Camk2b的启动子区,增强Camk2b转录激活进而促进下游细胞能量代谢和线粒体氧化磷酸化相关基因Pgc1α、Pdk4、Cs、Cox2、Cox4、Acadm、Acox1、Cycs、Atp5α1的表达,促进肌纤维类型由酵解型的快肌纤维向氧化型的慢肌纤维转化。6.在C2C12细胞迁移过程中,通过细胞划痕和细胞小室迁移实验表明,过表达Mdfi能够提高C2C12细胞的迁移率,敲除Mdfi能够降低C2C12细胞的迁移率。q RTPCR结果表明过表达Mdfi能够显著上调Fak和Paxillin,敲除Mdfi能够显著下调Fak和Paxillin;同时,过表达Mdfi能够促进细胞黏附相关基因Cdh1、Cdh10、Col6a3、Itga4、Itgb4、Itgb6的表达,敲除Mdfi能够抑制细胞黏附相关基因Col6a3、Itga4、Itgb6的表达。Western blot结果表明,过表达Mdfi能够促进p-Fak,Fak,p-Paxillin和Paxillin的蛋白表达,敲除Mdfi能够抑制p-Paxillin和Paxillin的蛋白表达。Ch IP试验和双荧光素酶报告系统检测结果表明,Myogenin能够通过结合Itga4和Itgb4的启动子区,激活Itga4和Itgb4的转录表达。由此可见,Mdfi能够通过促进Myogenin的表达,促进Itga4和Itgb4的转录激活,通过进一步激活Fak-Paxillin信号通路来促进C2C12细胞的黏附和迁移。7.Mdfi基因启动子研究结果表明,Mdfi启动子核心正调控区域为-1475/-1386和+23/+120两个区域,核心负调控区域为-1306/-1084和-291/-111两个区域;通过双荧光素酶报告系统、生物信息预测和Ch IP实验验证结果表明,Myod能够结合在Mdfi启动子-1297/-1285区域,抑制Mdfi的转录活性,而Myogenin能够结合在Mdfi启动子+29/+39区域,促进Mdfi的转录活性。免疫共沉淀实验结果表明,Mdfi蛋白能够分别和Myod、Myogenin发生直接的相互作用。由此可见,Mdfi蛋白能够和Myod、Myogenin发生互作,同时,在Mdfi转录起始位点上游确实存在Myod和Myogenin的结合位点,Myod能够负反馈调节Mdfi的表达,而Myogenin能够正反馈调节Mdfi的表达。综上所述,本研究通过转录组测序分析和分子实验验证阐明了Mdfi在C2C12细胞发育过程中的功能及分子机制。在增殖过程中,Mdfi能够抑制C2C12细胞的增殖;在分化过程中,Mdfi能够促进C2C12细胞的分化同时能够促进肌纤维类型由酵解型的IIb型肌纤维向氧化型的I型肌纤维转化;在迁移过程中,Mdfi能够促进C2C12细胞的迁移。Mdfi在C2C12细胞成肌发育过程中发挥着广泛而重要的作用。