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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是一种世界性分布的重要病害。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种重寄生真菌,对油菜菌核病生物防治而言具有广阔的应用前景。前人研究已经报道,核盘菌能够分泌草酸酸化环境pH,盾壳霉在酸化pH下能够合成抗真菌物质(AFS),抑制核盘菌菌丝生长和菌核萌发。另一方面,盾壳霉具有降解草酸的能力,使环境pH值上升,从而提高盾壳霉产生重寄生相关细胞壁降解酶量及活性。这些结果表明环境pH在盾壳霉与核盘菌的互作过程中扮演重要角色。前期研究已经从盾壳霉中获得了pacC/Rim101的同源基因CmpacC,但对于CmpacC基因的功能及pH感应调控系统中的其它基因尚不清楚。针对这些问题,本研究采用原生质PEG介导转化的基因敲除和互补技术分别对CmpacC,以及pH感应信号途径(Pal)中相关基因CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF、CmpalH和CmpalI等进行了功能分析,并对这些基因在盾壳霉重寄生、降解草酸和产生抗真菌物质中的作用进行了分析,取得的如下研究结果:第一,明确了核心转录因子Cmpac C对盾壳霉菌丝发育以及感应胞外高盐高渗压力能力的影响。目前通过原生质体PEG介导转化技术已经获得CmpacC基因的敲除转化子(?CmpacC-21、?CmpacC-29、?CmpacC-46)以及互补转化子(?CmpacC-29C)。与野生型菌株Chy-1相比较,?CmpacC-29突变体在弱酸性或者碱性pH下的菌丝生长受到显著抑制,同时?CmpacC-29突变体的产孢量也显著降低。另外,CmpacC的敲除使得盾壳霉对胞外高盐高渗压力也更为敏感,但是对于胞外的重金属离子和过氧压力却没有明显的区别,由此也可以看出CmpacC在盾壳霉对高盐高渗压力的抗性方面起着重要的调控作用。第二,明确核心转录因子CmpacC在pH感应调控系统中对盾壳霉寄生核盘菌、降解草酸的能力以及抗真菌活性的转录调控机制。通过比较?CmpacC-29突变体与野生型菌株Chy-1和互补转化子?CmpacC-29C对核盘菌的重寄生能力、降解草酸盐的能力以及抗真菌活性。结果显示:与野生型菌株Chy-1和?CmpacC-29C相比,?CmpacC-29突变体对核盘菌菌丝和菌核的重寄生能力明显降低,但是?CmpacC-29突变体降解草酸盐的能力以及产抗真菌物质的能力显著增强。为了阐释?CmpacC-29突变体如何影响盾壳霉寄生核盘菌的能力、降解草酸盐的能力以及产抗真菌的能力,我们通过荧光定量PCR以及酶活试验,表明?CmpacC-29突变体的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及蛋白酶基因的表达量,以及相对应酶的活性显著低于野生型chy-1和互补转化子?cmpacc-29c,但是?cmpacc-29突变体的cmoxdc1的表达量以及总的草酸脱羧酶的活性显著高于野生型chy-1和互补转化子?cmpacc-29c。酵母转录激活试验以及emsa试验结果进一步证实了cmpacc是一种转录因子,可以直接与cmg1、cmch1以及cmoxdc1的启动子序列中的保守结合位点(gccarg)结合。由此可以推出cmpacc正调控着盾壳霉对核盘菌的寄生,但同时也负调控着草酸盐降解以及抗真菌的活性。第三,从盾壳霉野生型菌株chy-1中克隆得到了5个pal基因同源物,即cmpala(genbank登录号:kp747602)、cmpalb(genbank登录号:kp747603)、cmpalc(genbank登录号:kp747604)、cmpalf(genbank登录号:kp747605)、cmpalh(genbank登录号:kp747606)和cmpali(genbank登录号:kp747607)。系统进化分析结果显示:cmpala、cmpalc、cmpalf和cmpalh与油菜黑胫病菌(leptosphaeriamaculans)中的同源基因亲缘关系最近,而cmpalb与小麦褐斑病菌(pyrenophoratritici-repentis)的palb亲缘关系最近,cmpali与小麦叶枯病菌(phaeosphaerianodorum)的pal1亲缘关系最近。第四,通过原生质体peg介导转化技术成功获得了cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh等5个基因的敲除转化子,分别命名为?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26。cmpali基因的敲除转化子目前仍然没有获得。与野生型菌株chy-1相比较,在ph>6的条件下,突变体?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26菌株生长明显受到抑制,说明缺失这些基因使得盾壳霉对碱性ph值环境更加敏感。基因表达量分析结果显示:在这些突变体中,核心转录因子cmpacc的表达量非常低。可能的原因在于:cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh等5个基因位于cmpacc的上游,敲除这些基因可能阻断cmpacc编码产物的剪切,使得cmpacc蛋白无法进入细胞核中调控自身表达。第五,明确了cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh对盾壳霉重寄生作用以及抗真菌作用的影响。在重寄生作用方面,对峙培养试验结果表明:与野生型菌株chy-1相比较,菌株?cmpala-33、?cmpalb-13和?cmpalc-5寄生核盘菌菌丝能力显著降低,而菌株?cmpalf-50、?cmpalh-26寄生核盘菌菌丝的能力没有明显变化。但是,菌株?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26寄生核盘菌菌核的能力均有显著降低。抗真菌作用测定结果表明:mcd为基本培养基,菌株?CmpalA-33、?CmpalB-13、?CmpalC-5、?CmpalF-50、?CmpalH-26在pH8的条件下培养时,培养滤液抑制核盘菌菌丝生长的效果显著高于野生型菌株Chy-1。原因可能在于菌株?CmpalA-33、?CmpalB-13、?CmpalC-5、?CmpalF-50和?CmpalH-26中核心转录因子CmpacC表达量太低,使其不能抑制抗真菌作用相关基因的表达。根据上述试验结果,可以看出:CmpacC及其Pal信号通路基因在盾壳霉与核盘菌的互作中扮演重要角色。在盾壳霉与核盘菌互作的早期,核盘菌在菌丝生长的同时会分泌草酸,从而为自身菌丝的生长创造酸性的环境,盾壳霉在酸性的环境条件下会分泌草酸脱羧酶来降解草酸,随着草酸的降解,环境的pH值会随之增高。随着环境pH的升高,盾壳霉菌株通过以Cmpac C为核心转录因子的pH信号传导通路感应胞外的碱性pH信号,通过两步剪切加工形成有活性的CmpacC蛋白进入盾壳霉的细胞核中,与靶标蛋白基因(β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及草酸脱羧酶)的启动子序列中的保守结合位点(GCCARG)结合来调控盾壳霉对核盘菌的重寄生、草酸降解以及抗真菌的活性。