拟杆菌是肠道菌群的核心成员之一,含有大量编码碳水化合物活性酶的基因,且能够根据需要进行稳定的转换,降解或发酵人消化道难以消化的膳食纤维,产生大量的如乙酸、丙酸等短链脂肪酸及葡聚糖等代谢产物,从而帮助宿主分解多糖提高营养利用率、加快肠粘膜的血管形成以及免疫系统发育以提高宿主的免疫力并维持肠道微生态平衡。拟杆菌群之间既交互共生也相互拮抗,在人体肠道内表现较厚壁菌稳定。且不同的菌株能促进或抑制宿主的炎症反应。然而,受限于拟杆菌的普通分离手段,研究目标多为肠道内丰度较高的拟杆菌。因此,本文拟在现有研究基础上进一步完善肠道拟杆菌的分离方法,特别是建立针对低丰度拟杆菌的选择性筛选;以拟杆菌生理作用研究模式菌种脆弱拟杆菌为对照,研究低丰度拟杆菌对肠道菌群的调节模式;并通过体外和体内模型研究低丰度拟杆菌对肠道免疫的调节作用;并在此基础上探索具有益生功能的低丰度拟杆菌的安全性,为其后续的应用打下基础。具体研究结果如下:首先,根据拟杆菌对不同碳源的利用特性,优化现有拟杆菌筛选培养基,建立了两种针对肠道内低丰度拟杆菌的有效分离手段。其一是以木聚糖、鼠李糖或甘露醇为唯一碳源的培养基进行拟杆菌筛选,实验证明,以上三种碳源均能够提高低丰度的卵形拟杆菌(B.ovatus)的分离效率,并且,以木聚糖为唯一碳源的培养基还能够提高Prevotella corpi的分离效率,同时分离到了普通拟杆菌筛选方法未分离到的B.xylanisolvens。其二是青霉素浓缩法,将菌群样品经添加了青霉素并以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基富集4h后,再进行拟杆菌分离,能针对性地提高不能利用阿拉伯糖的低丰度B.cellulosilyticus及脆弱拟杆菌(B.fragilis)的分离效率。其次,采用正常小鼠及炎症小鼠模型,研究低丰度的卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对肠道菌群的调节作用。实验发现,低丰度拟杆菌对正常小鼠肠道菌群调节作用不明显,特别是卵形拟杆菌ELH-B2对菌群组成及SCFA分泌的调节作用还要弱于脆弱拟杆菌HCK-B3。同时,卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌均能缓和因LPS引起的菌群紊乱,特别是降低了与肿瘤形成相关的部分菌种,但脆弱拟杆菌降低了肠道中极少数短链脂肪酸的生成。再次,通过报告基因表达细胞株模型、健康小鼠及炎症小鼠模型研究低丰度的卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对宿主免疫的调节作用。在细胞模型中,所有的拟杆菌株均能激活Thp1-XBlue中NF-κB信号通路,并且不同拟杆菌对Thp1-XBlue细胞中NF-κB信号通路的激活水平存在种间差异。卵形拟杆菌针对NF-κB信号通路的激活及调节水平相对偏低,而脆弱拟杆菌则对LPS激活的NF-κB信号通路表现出明显的上调作用。在健康小鼠模型中,卵形拟杆菌ELH-B2对小鼠体内细胞因子、脾脏Treg细胞、NF-κB信号通路的激活水平等指标均无明显影响,脆弱拟杆菌HCK-B3虽明显激活了结肠组织中NF-κB信号通路,并且提高了结肠组织的通透性,但对结肠的组织结构无影响。已有研究报道,拟杆菌能够缓解由致病菌定植或恶唑酮等药物使用而引起的炎症,针对因肠道菌群紊乱或过量抗生素使用导致释放出大量LPS引起的感染尚未有研究报道。因此,本文建立LPS感染的小鼠炎症模型,实验发现,ELH-B2能够增加Treg细胞数量,从而帮助LPS炎症小鼠重新建立Treg/Th-17平衡。脆弱拟杆菌HCK-B3还能够降低促炎因子TNF-α、提高抑炎因子IL-10,进而缓解LPS炎症引起的炎症。脆弱拟杆菌虽显著上调了LPS炎症小鼠体内NF-κB信号通路及结肠组织通透性,然而未影响结肠组织的完整性。依据已有研究判断,这类轻微地破坏作用实则为其通过腹膜发挥进一步的抑炎作用打下基础。综合上述低丰度拟杆菌对肠道菌群及宿主免疫调节作用的研究成果,卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3也具有新一代益生菌的潜质。因此,对其在体内的安全性进行了深入的评价,为后续的商业及临床应用打下基础。实验发现,卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3均无鞭毛,无运动性。HCK-B3无溶血性,但ELH-B2轻微溶血。经过全基因组序列比对,未发现与ELH-B2及HCK-B3完全相同的已知菌株。ELH-B2及HCK-B3基因组中不存在明确致病的毒力基因及基因岛,并且与脆弱拟杆菌ATCC25285相似,HCK-B3存在合成多糖A(PSA)的重要基因。ELH-B2及HCK-B3均能耐受氨苄青霉素、头孢曲松钠、克林霉素、卡那霉素、红霉素及多粘菌素,ELH-B2还能耐受环丙沙星及万古霉素,然而,ELH-B2及HCK-B3的基因组中均不含质粒与抗生素耐受因子转运相关的基因岛,因此其抗生素的耐受特性转移至其他肠道菌的可能性较小。通过急性小鼠实验发现,每日10~9 cfu剂量的卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3对健康小鼠无毒副作用。为进一步验证这两株拟杆菌的安全性,采用了环磷酰胺造模的免疫低下小鼠,环磷酰胺对小鼠免疫系统的抑制表现为体重下降、免疫细胞、血小板及血红蛋白的减少及脾脏组织结构的严重破坏。但每日10~9 cfu剂量的卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3对免疫低下小鼠体重、血常规、肝功能、细胞因子分泌及肝脏、脾脏、结肠的组织结构均无影响,而且能够部分恢复异常的肝功能指标,HCK-B3还提高了免疫抑制小鼠体内抑炎因子的浓度。