随着重组DNA技术的飞速发展，已经出现了多种生产重组蛋白的表达系统，其中以转基因动物生物反应器，尤其是转基因哺乳动物的乳腺生物反应器和转基因家禽的输卵管生物反应器的优点最为突出，能在不损伤机体正常生理功能的条件下源源不断地获得表达产品。家禽具有繁殖周期短、生产性能高、研究成本较低等优点，其输卵管是生产蛋白质的天然“发酵罐”，更加适合作为生产重组蛋白的生物反应器。但由于家禽特殊的生殖生理特点，其转基因技术一直落后于其它动物。虽然近几年来相关技术有所突破，但家禽转基因研究仍有许多理论和技术难题有待突破，距离产业化开发仍有很远的路要走。为此，寻求禽类的转基因技术的突破和开辟新的研究方法已成为当前研究工作的重点。 本课题组用自行克隆的鸡卵清蛋白(OV)基因表达调控序列构建成鸡输卵管定位表达载体，以人溶菌酶和组织激肽释放酶(hK1)基因为目的基因的鸡输卵管暂态表达试验结果表明，通过翅静脉注射一定剂量的重组载体后，能表达一定水平的重组酶并分泌到试验鸡的蛋清中，具有一定的开发利用价值。本研究在前期研究的基础上，以hK1基因为目的基因，通过对先前构建的鸡输卵管特异表达载体进行优化改造，旨在获得结构更为合理、表达水平更高、维持时间更长的表达载体。在先前构建的pOV3K载体的基础上，分别通过酶切消化或PCR扩增等方法，将其中3.0kb的OV基因5-调控序列的长度分步缩减，获得三个新的重组载体分别命名为pOV4K、pOV5K和pOV6K。将此重组载体与25kDa聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)混合，经翅静脉注射产蛋鸡，用标准方法检测蛋清中的重组酶活性，结果表明，含1.1kbOV基因5-调控序列的pOV6K表达水平和表达时间均不如含3.0kbOV基因5-调控序列的pOV3K，含2.1kbOV基因5-调控序列的pOV4K和含1.7kbOV基因5-调控序列的pOV5K与含3.0kbOV基因5-调控序列的pOV3K表达水平相当，说明1.7kbOV基因5-调控序列足以指导外源基因的表达。为了进一步增强外源基因的表达水平，将由pOV5K中的1.7kbOV基因5-调控序列、hK1cDNA及牛生长激素基因终止信号(BGHpA)组成的表达盒，插入到含禽腺联病毒(AAAV)ITR和Rep蛋白基因的载体中，旨在获得稳定表达载体，获得新的重组表达载体命名为pITRLRepOV5K。用上述方法将PEI包被的重组载体注射产蛋鸡，蛋清中的重组酶活性检测结果表明，在注射相同拷贝数重组载体的条件下，重组载体pITRLRepOV5K的表达量及维持时间均优于pOV5K，不仅获得了结构更为合理、表达水平更高、维持时间更长的鸡输卵管特异表达载体，而且为以AAAV为基因转移载体制备转基因鸡输卵管生物反应器打下了基础。 鉴于以pITRLRepOV5K载体建立的鸡输卵管暂态表达技术的潜在应用价值，有必要对其进一步研究。将2mgpITRLRepOV5K载体与PEI混合后注射产蛋鸡，对注射蛋鸡组织进行重组酶活性检测，结果显示外源基因表达仅限于鸡的输卵管组织，提示重组载体表达具有较好的组织特异性；在初次载体注射后检测蛋清中重组酶含量，当表达水平降至30U/ml左右时进行下一次注射，蛋清中的重组酶活性检测结果表明，重复注射后重组酶的表达水平较初次注射接近或略高，表达时间有所延长，三次注射后可使重组酶表达维持在较高水平达43.8U/ml，且可维持10天左右。通过多次重复注射，重组酶可持续高表达一个月之久。载体重复注射对产蛋鸡的产蛋、体温、体重等生理指标均无明显影响，显示出更好的进一步研究和开发利用价值。