近年来,越来越多的诸如II型糖尿病、帕金森综合征、阿尔茨海默氏症等淀粉样沉积疾病被广泛的报道,而这些淀粉样沉积疾病也成为了困扰老年人的主要疾病之一。由于老年人体内的酶活性较低,在一些蛋白的代谢过程中发生错误折叠与错误切割,而老年人体内免疫系统也逐渐老化,错误折叠与错误切割产生的无用蛋白无法被及时清除,在胞内大量聚集,形成淀粉样纤维,进而引发淀粉样沉积疾病。针对这些淀粉样沉积疾病,目前还没有有效的治疗手段。获得大量具有高纯度、有代表性的淀粉样沉积前体蛋白是深入探究蛋白质错误折叠和聚集分子机制的前提和保证。结合体外的蛋白成纤维培养实验和体内的蛋白聚集情况检测来构建抗蛋白聚集的抑制剂筛选平台,寻找具有对蛋白聚集、纤维化有抑制效果的小分子抑制剂则是目前研究淀粉样蛋白沉积疾病有效治疗策略的焦点。为了解决对淀粉样蛋白的成纤维过程中不同阶段的有效抑制的问题,我们从分别选择了典型淀粉样蛋白鸡溶菌酶和人β-淀粉样蛋白作为模型蛋白进行抗淀粉样蛋白聚集小分子化合物的筛选,并以改造酵母PDI基因为中心构建并完善基于酵母的对体内非正确折叠蛋白的模拟。人溶菌酶是研究淀粉样蛋白沉积疾病的经典模型蛋白,而鸡溶菌酶与人溶菌酶具有高度的同源性,在极端环境下,鸡溶菌酶蛋白结构被破坏,疏水核心暴露,聚集成为寡聚体,新的蛋白单体依次添加,最终形成无支链的淀粉样蛋白纤维。木脂素与环肽广泛存在于亚麻属植物中,已有研究证明它们与多酚类小分子一样具有广泛的抗癌症、抗炎症、抗氧化等多种药物作用。但是作为抗淀粉样蛋白成纤维抑制剂的研究鲜有报道。本研究选取了5种具有代表性的木脂素与2种环肽作为筛选抗淀粉样蛋白成纤维的候选化合物,选取鸡溶菌酶作为成纤维蛋白。研究发现,木脂素具有一定程度的抑制淀粉样蛋白成纤维的能力,但是与阳性对照的多酚类物质桑色素相比,抑制效果远低于桑色素的抑制效果。通过之前分子动力学相关研究推测,桑色素与鸡溶菌酶表面凹槽中的特定位点结合,阻碍了蛋白纤维延长,而木脂素分子量较大,无法进入溶菌酶表面凹槽中,但随着浓度的增加它极有可能附着在蛋白表面,从而减少蛋白与水分子的结合,通过蛋白分子自身的疏水作用维持了蛋白结构的稳定。本研究在使用动物源淀粉样蛋白进行成纤维抑制实验的同时,尝试通过毕赤酵母表达系统,大量表达分泌人源Amyloid-β蛋白。Amyloid-β蛋白属于典型的淀粉样蛋白,是阿尔茨海默氏症的主要病原蛋白。Amyloid-β具有成纤维周期短,寡聚体细胞毒性大等特点,被广泛的应用于人源淀粉样蛋白的研究。但是Amyloid-β蛋白来源于化学合成,获得成本较高,而且纯度较低。本研究尝试利用毕赤酵母真核表达系统高效表达Amyloid-β蛋白,为淀粉样蛋白成纤维抑制物的筛选提供廉价、高纯度原料蛋白。在胞内实验方面,我们以兼具分子伴侣和二硫键异构酶功能的PDI基因为核心,尝试模拟老化细胞的体内微环境,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,定向敲除毕赤酵母蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因,构建品质管理系统缺失菌株,为研究淀粉样蛋白胞内聚集奠定基础。另一方面,利用毕赤酵母分泌系统大量分泌二硫键缺失及非正确折叠淀粉样蛋白,为小分子抑制物的筛选提供了更加便利的条件。