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目的:高尿酸会引发高尿酸血症,进而发展为痛风,引发心血管和慢性肾脏疾病。既往研究表明,高尿酸是细胞内的促氧化剂,可能诱导细胞的氧化应激、线粒体功能失调以及炎症反应,从而导致内皮功能障碍。然而,高尿酸调控的分子机制目前尚不十分清楚。本项研究分别以人肾小球系膜细胞(HRMC)和痛风患者血浆为研究对象,采用蛋白质组学技术,结合生化实验和生物信息学分析,研究高尿酸作用下,蛋白质组的分布特征和变化规律,鉴定异常表达蛋白及分子网络,结合细胞行为、伴发疾病、生化指标等,探讨高尿酸在蛋白质层面的作用机制。方法:1.本研究选择人肾小球系膜细胞(HRMC)为研究对象,以不同浓度的尿酸进行干预,根据细胞增殖能力选择合适的尿酸干预条件,再利用蛋白质组学技术鉴定每一组HRMC细胞蛋白的表达情况,分析差异性蛋白,并研究蛋白定位、属性、互作网络及分子通路等特征,研究差异性蛋白的生物学意义,结合细胞增生、凋亡等细胞行为测试结果,探讨高尿酸对HRMC的作用机制。2.选取16例痛风患者(8例单纯痛风、8例痛风伴肾损伤)为研究对象,同时选择8例健康成人作为对照组。采用蛋白质组学策略,研究血浆中蛋白质的表达,并进行定量分析。采用统计学方法,筛选差异性表达蛋白,借助生物信息学工具研究它们的定位、网络和通路关系,结合临床伴发疾病、生化指标等参数,以及生物信息学手段,研究痛风异常蛋白表达的生物学意义,探讨其临床潜在价值。结果:1.高尿酸(UA)对人肾小球系膜细胞蛋白质网络及细胞行为调控。(1)HRMC细胞用0.1mM,0.3mM,0.5mM和0.7mM UA分别刺激6h,12h,24h,48h及72h,与对照组(NC)相比,0.1mM,0.3mM组细胞增殖能力无明显变化,而在48小时0.5mM和0.7mM组细胞增殖能力明显下降(P<0.05),在72小时0.7mM组细胞增殖能力亦明显下降且稳定(P<0.05)。(2)将HRMC细胞经0.7mM UA处理48小时,采用Bottom-up蛋白质组学策略共鉴定了1977个蛋白质,经与对照组定量分析,发现差异性表达蛋白有314个,其中186个蛋白表达上调,128个蛋白表达下调。(3)生物信息学分析表明,高尿酸引起HRMC细胞蛋白网络的异常,其中内质网蛋白的异常较为显著。(4)细胞行为分析发现,随着尿酸浓度的增加,细胞凋亡比例逐渐增多,如0.7mM UA组细胞早期凋亡及晚期凋亡比例均明显增多(分别为14.24%、5.41%)。结合蛋白质定量分析结果,发现STK3、Cleaved CASP3、CANX和HSP B1等与凋亡相关的蛋白均发生异常表达,Western blot进一步验证上述结果。2.痛风患者血浆蛋白质异常表达及其生物学意义研究。(1)痛风组高血压、高脂血症、代谢综合征的检出率明显高于对照组。(2)与对照组相比,痛风组的SUA、DBP、TG、CHO和ALT的水平均高;但ALT均在正常范围内。(3)与单纯痛风组相比,痛风伴肾损伤组的Scr、BUN及HOMA-IR的水平均高;而痛风伴肾损伤组的eGFR较单纯痛风组水平降低。(4)正常对照组和痛风患者的血浆蛋白进行比较,共有32个差异性蛋白。与对照组相比,痛风组10个蛋白表达增加,22个蛋白表达下降。这些蛋白质依据功能的不同,被分成五组,相互作用网络分析表明它们之间存在紧密联系。(5)单纯痛风和痛风伴肾损伤患者的血浆蛋白进行比较,发现10个差异性蛋白,痛风伴肾损伤患者血浆补体C4A、C4B及SERPINF1表达较单纯痛风患者增强。(6)将血浆蛋白定量结果与经典的临床生化指标(包括SUA、eGFR、Cr等)进行相关性分析,;发现相关性规律,提示鉴定的异常蛋白具有标志物潜力。结论:1、高尿酸可引起HRMC细胞蛋白分子网络发生异常,涉及多种生理过程和细胞行为,其中细胞凋亡增加较为明显,其机制可能为触发内质网应激,激活Caspase通路。2、发展了基于蛋白质组学技术的痛风患者血浆蛋白质组分析方法,并鉴定了其中异常蛋白分子,且与临床生化指标和伴发疾病具有相关性;其中免疫炎症反应相关蛋白异常显著,提示与痛风关联密切;另外,结合生物学功能分析,暗示GSN等异常蛋白具有作为痛风疾病指标的潜在价值。