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目的:通过分选、鉴定儿童急性淋巴细胞白血病干细胞,建立白血病干细胞/NOD-SCID小鼠白血病模型,观察其对小鼠生存的影响,并分析白血病干细胞与急淋临床特征及预后的关系;研究β-arrestinl以及相关基因在白血病干细胞中的表达,探索白血病干细胞影响急淋的发病机制,为寻找儿童急淋治疗的靶点提供实验基础。
方法:通过免疫磁珠分选法分选、流式细胞术分析、RT-PCR和荧光原位杂交技术鉴定急淋患儿骨髓中的白血病干细胞,并将该群细胞经尾静脉注入辐照后的NOD-SCID小鼠体内,建立小鼠白血病模型。
利用流式细胞术检测急淋患儿骨髓中白血病干细胞表面标记CD34+CD38。的表达,分析具有白血病干细胞表面标记的细胞与急淋临床特征及预后的相关性,并利用建立的白血病小鼠模型验证该群细胞对急淋预后的影响。采用real-time RT-PCR、免疫荧光、免疫组化等技术检测β-arrestinl在病人骨髓分选细胞和小鼠骨髓单个核细胞中mRNA和蛋白的表达水平,real-time RT-PCR检测相关基因的表达。
结果:经流式细胞术成功分选出CD34+ CD38-白血病干细胞群,且该群细胞表达白血病干细胞相关的分子标记CD19和急淋相关融合基因。尾静脉注射入NOD-SCID鼠体内后,小鼠外周血白细胞数逐渐增高,可见幼稚细胞,骨髓呈急淋骨髓像,说明成功建立了白血病小鼠模型。注入CD34+CD38-细胞群小鼠的总体生存率低于CD34-CD38+组和空白对照组小鼠(P＜0.05)。检测和分析临床ALL患儿的标本,发现CD34+CD38-的表达与急淋的预后因素有关,如年龄、外周血白细胞数、外周血原始细胞数、细胞遗传分类、融合基因、化疗反应、髓外浸润及危险分级(P＜0.05)。此外,与对照组相比,CD34+CD38-细胞中β-arrestin1 mRNA和蛋白的表达增高(P＜0.05);real-time RT-PCR检测发育相关基因的mRNA表达,结果发现Wnt3α和β-catenin在CD34+CD38-细胞中的表达较对照组高,以β-catenin增高更为明显(P＜0.05)。
结论:成功分选与鉴定了儿童急性淋巴细胞白血病干细胞,并建立了NOD-SCID小鼠白血病模型,注射CD34+CD38-细胞群小鼠的总体生存率明显降低。临床研究发现CD34+CD38-的高表达与儿童急淋预后差相关。Β-arrestin1、Wnt3α和β-catenin在CD34+CD38-细胞群中呈高表达。