碳酸钙微球作为p53基因载体的研究

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肿瘤发生多数与基因突变有关,因此,通过基因治疗手段改造或纠正突变基因对于癌症治疗具有重要意义。基因载体的安全性和有效性是实现基因治疗的关键因素之一。研究高效、安全的基因载体是当前研究的焦点。本论文采用化学沉淀法制备出三种不同性质的碳酸钙微球,并将碳酸钙(CaCO3)微球作为基因载体,用聚乙烯亚胺(PEI)表面修饰,探究经PEI修饰的碳酸钙微球作为基因传递载体的可能性及其携载重组质粒pEGFP-C1-p53的体内外抑癌效果。方法:(1)制备三种不同性质的球形CaCO3颗粒,通过场发射扫描电镜(SE-FEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)以及动态光散射(DLS)等方法对合成的CaCO3颗粒形貌、粒径和结晶度等性质进行表征,建立稳定合成碳酸钙微球的工艺路线。(2)采用聚乙烯亚胺PEI对纳米结构的CaCO3微球表面修饰。研究表面修饰后的碳酸钙微球携载p53基因转染多种癌细胞和正常细胞(Hep3B、H1299、Hela、QSG-7701和293a)的效果。通过荧光显微镜观察GFP-P53融合蛋白的表达。(3)通过MTT实验研究碳酸钙微球的生物安全性及CaCO3-PEI-pDNA复合物的抑癌效果;Hoechst33342染色研究复合物的抑癌机理。(4)构建裸鼠Hep3B肝癌移植瘤模型,瘤内注射碳酸钙载体-基因复合物,探究修饰后的碳酸钙微球的体内抑癌效果,并通过肿瘤组织切片HE染色和TUNEL染色等病理学结果分析抑癌机制。结果:(1)通过添加不同的调控剂,制备出三种不同形貌、晶型及粒径大小的CaCO3微球,平均粒径分别为:960nm、976nm和510nm。三种颗粒形貌均为球形,分散性良好,粒径分布较均一且表面粗糙度较大。(2)通过研究在不同pH值条件下碳酸钙微球的降解情况,实验结果显示碳酸钙微球在酸性pH下能够更快速地降解,且与其它两种微球颗粒相比,SCa微球的酸性pH依赖性更大。说明碳酸钙微球能够响应酸性pH值,具有pH依赖性。通过研究不同浓度下碳酸钙微球的生物相容性情况,结果发现在一定浓度范围内三种碳酸钙微球的毒性较低,表明这三种碳酸钙微球都具有良好的生物相容性,且ACa的生物相容特性最佳。(3)体外细胞实验证实经表面修饰的CaCO3微球作为基因载体携载p53基因能够将基因传递至细胞内并成功表达融合蛋白GFP-P53,有效地抑制癌细胞增殖。(4)体内动物实验结果显示SCa-PEI-pEGFP-C1-p53能有效地抑制肿瘤生长。
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