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林可霉素是林可酰胺类抗生素的重要成员之一。作为临床上广泛使用的一类抗菌素,林可霉素通过抑制细菌蛋白质的合成影响细菌的生长,因而用于治疗各类感染性疾病。虽然通过发酵工艺的改进和菌种的选育可以提高林可霉素的产量,但均具有一定的局限性,而基因工程改造是实现林可霉素生产能力飞跃的有效策略。林可霉素的生物合成途径已被初步解析,其调控机制也变得逐渐清晰,但负责林可霉素生物合成的基因簇(lmb)内仍有部分基因功能未知。其中,基因lmbIH和lmbQ生物信息学预测其编码产物属于PmbA-TldD家族,但作用机理未知,因此探究lmbIH和lmbQ的功能有望完善林可霉素生物合成与调控过程,为林可霉素高产菌株的遗传改造提供操作靶点。为了探究林可霉素簇内基因lmbIH和lmbQ的功能,本论文采用CRISPR/Cas介导的链霉菌基因组编辑技术,以林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)野生株NRRL2936为出发菌株,分别构建了lmbIH和lmbQ单基因敲除株和双基因联合敲除株。发酵结果显示,lmbIH和/或lmbQ的缺失显著降低林可霉素的合成,但不影响孢子的形成。同时,为了探测lmbIH和lmbQ的编码产物是否存在PmbA-TldD家族的多肽裂解活性,进行了体外测活和体内活性分析。体外测活分析中,首先在大肠杆菌中实现了lmbIH和lmbQ的重组表达,并通过包涵体变复性纯化得到的重组LmbIH和LmbQ蛋白;基于质谱分析的短肽裂解活性分析则表明,和阳性对照相比,所选条件下重组蛋白无体外短肽裂解活性。体内活性分析中,针对推测的LmbIH和LmbQ潜在作用底物LmbU、LmbN及LmbA,在其编码基因C末端原位引入Flag标签,基于Western-Blotting分析发现,靶蛋白Flag标记物在LmbIH和LmbQ野生株与缺失株中未见明显阳性条带,可能链霉菌体内靶蛋白的表达水平较低,未来需进一步提高靶蛋白的表达量后进行活性分析。综上所述,基因lmbIH和lmbQ正调控林可霉素的生物合成,但其具体的作用机理还需进一步分析。