半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）是一类广泛存在于各种生物体内的蛋白酶抑制因子，参与多种生物学及病理学进程。家蝇Musca domestica 常常生活在在病原菌滋生的恶劣环境中，具有很强的适应能力，了解其独特的免疫及发育调控机制，将为研究昆虫生理、免疫以及杀虫等方面提供新的途径。　　 本论文以家蝇为研究对象，研究内容主要分为5个部分：　　 第1部分：通过转录组数据分析、RT-PCR及RACE 技术从家蝇幼虫体内克隆获得个不同半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA 序列，经过同源分析，将其分别命名为：　　 Mdcystatin A（MdCYA），Mdcystatin B1（MdCYB1）和Mdcystatin B2（MdCYB2），并对其氨基酸序列进行了分析；　　 第2 部分：以家蝇管家基因β-actin及GAPDH作为内参分子，利用实时定量RT-qPCR对经大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激，不同组织，不同发育阶段，不同营养条件下MdCYA，MdCYB1和MdCYB2基因的mRNA表达水平进行定量分析；　　 第3 部分：构建了家蝇MdCYA，MdCYB1和MdCYB2基因的原核表达载体，并在大肠杆菌DE3 体内进行诱导表达，以木瓜蛋白酶为底物，分析了重组蛋白的蛋白酶抑制活性。　　 第4 部分：用rMdCYA蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清，利用免疫组化技术分析了MdCYA在家蝇幼虫体内的分布情况。　　 第5 部分：应用RNA 干扰技术，饲喂家蝇幼虫能表达dsRNA的细菌，有效抑制虫体中靶基因的表达，分别研究MdCYA和MdCYB1基因在变态发育中所起的功能。　　 研究结果：　　 （1）MdCYA基因cDNA 全长416 bp，包含一个357 bp的完整开放阅读框（ORF），根据ORF 推导的MdCYA 多肽由118个氨基酸残基组成，SignalP 3.0程序预测N 端包括17个氨基酸残基的信号肽，MdCYA 成熟肽由101个氨基酸残基组成，理论分子量为10.8 kD，理论等电点为5.37。同源性分析表明，与棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina的Sarcocystatin A 相似性最高（identity=51％）。MdCYB1基因cDNA 全长607 bp，编码123个氨基酸残基，N 端包含22个氨基酸残基的信号肽，成熟肽由101个氨基酸残基组成，理论分子量为11.3 kD，理论等电点为9.23。同源性分析表明，氨基酸与红尾肉蝇S. Crassipalpis的Sarcocystatin B 具有最高相似性（identity=62％）。　　 MdCYB2基因cDNA 全长400bp，编码110个氨基酸残基，N 端不存在信号肽，理论分子量为12.2 kD，理论等电点为6.10。同源性分析表明，氨基酸与红尾肉蝇的Sarcocystatin B 具有最高相似性（identity=58％）。　　 （2）RT-qPCR分析表明在分别被大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激后家蝇幼虫体内MdCYA表达量明显下调，而MdCYB1和MdCYB2基因表达量在刺激后显著上调，分别在48 h和6 h 达到高峰，MdCYB2 可能参与家蝇幼虫的免疫调控，MdCYB1很可能是由于家蝇幼虫受到刺激而后准备提前化蛹，从而引发MdCYB1表达量的升高；组织定量分析表明，3种基因均在脂肪体与血细胞中有较高水平的表达；在不同发育阶段中，MdCYA在化蛹阶段表达量最低，而MdCYB1和MdCYB2在此时期表达量最高，提示该3种基因在调控变态发育中扮演不同的角色；在不同营养条件下该3种基因均无显著变化。　　 （3）利用原核表达系统成功实现了MdCYA，MdCYB1和MdCYB2基因的重组表达。　　 活性测定结果表明rMdCYA与rMdCYB-1具有较强的抑制活性，rMdCYB-2 未检测到抑制活性。　　 （4）应用重组蛋白rMdCYA免疫新西兰大白兔制备抗MdCYA抗血清，Western Blot结果表明此抗血清具有很好的特异性。根据MdCYA抗血清同家蝇总蛋白效价将抗血清稀释至适当浓度，用于免疫组化实验，结果表明MdCYA 主要分布于血细胞与脂肪体中。　　 （5）将目的基因MdCYA与MdCYB1分别克隆至L4440载体，在大肠杆菌HT115（DE3）中表达，将菌体对家蝇幼虫投喂，投喂含MdCYA菌的幼虫发育时间基本不变，而投喂MdCYB1菌的幼虫化蛹时间推迟。结果表明MdCYB1可能在家蝇幼虫化蛹过程中起重要作用。