中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是中国重要的淡水经济蟹类,有关其雄性生殖生物学方面的研究目前集中在精子发生、精荚形成、精子超微结构(Spermultrastructure)、精子代谢(Sperm metabolism)以及精巢EST序列分析等方面,而对副性腺的研究则相对薄弱。副性腺是中华绒螯蟹雄性生殖系统的重要组成部分,哺乳动物的研究证实,副性腺对雄性生殖具有重要影响,不仅能为精子提供营养,其中的某些因子还能使精子表面发生一系列的变化,包括影响精子的活力、生理状态、运动和获能以受精能力等。但是对于中华绒鳌蟹副性腺的具体功能及作用还不甚了解,对其内容物的具体成分也从未有过研究。精子顶体酶存在于精子顶体内,是一种胰蛋白酶(Trypsin),以未激活的原顶体酶前体形式存在顶体内。顶体酶作为受精过程中的关键酶,在精子穿透卵细胞透明带时起溶解透明带作用,为精卵结合提供了条件,因而其活性高低可直接影响受孕。精子顶体反应缺陷是精子功能障碍的重要原因之一,体外内试验表明,当顶体酶被抑制时,受精过程被阻止,而顶体酶活性的高低则与精子的质量成正相关,直接影响着受精的结果。因此,精子的顶体酶活性已经成为评价精液质量的重要指标,也是临床上对不明原因男性不孕患者一个较敏感的生物学指标之一。近期,本实验室通过构建中华绒螯蟹副性腺SSH文库,发现该器官对雄性生殖具有重要作用,同时首次发现了副性腺蛋白对精荚破裂的重要作用。为此,本文就副性腺对精荚的破裂作用以及对精子顶体酶活性的影响开展了相关的研究,以期为进一步探讨十足类甲壳动物雄性生殖的机理提供理论依据。蛋白质组(Proteome)定义为“基因组所表达的全部蛋白质”,即是指细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式,更为清楚的表述是细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。作为一门新兴学科,蛋白质组学以蛋白质组为研究对象,在整体水平上研究蛋白质组成与调控的活动规律。可以为我们提供如下信息:从基因序列预测基因产物是否及何时被翻译,基因产物的相对浓度,翻译后修饰的程度。这三点都无法单独从核酸序列进行精确预测,蛋白质组分析能不依赖于DNA序列信息而进行,而且反过来又有助于对基因组的进一步了解。它有效补充了差异显示、微点阵表达序列标签(EST)分析、直接或间接消减杂交、染色体连锁分析及核酸测序等基因组研究方法。本实验室前期对中华绒鳌蟹副性腺的研究发现,副性腺分泌蛋白可使其精荚破裂,从而释放精荚内的精子。然而,目前对该蟹副性腺功能的了解还仅限于此。为此,本研究运用双向电泳和质谱技术对副性腺分泌物进行相关研究,以期了解副性腺蛋白在发育过程中的作用,有助于阐明中华绒螯蟹生殖机理。一、不同游离精子获得方法对精子存活率以及顶体酶活性的影响本研究分别运用副性腺蛋白消化法、胰酶消化法、机械匀浆法三种不同方法获得中华绒螯蟹精子并对精子存活率和顶体酶活性进行检测,结果发现副性腺蛋白消化法得到的精子顶体酶活力最高,为(4.290±0.095)μIU/10~6;机械匀浆法得到的精子酶活力最低,为(1.423±0.109)μIu/10~6;3种方法得到的酶活力存在显著性差异(P<0.05)。二、相关组织蛋白对精子顶体酶活性的影响本研究对中华绒螯蟹未交配成熟雄蟹贮精囊内的精荚采用胰蛋白酶消化法获得游离精子后,分别用纳精囊匀浆液、贮精囊壁匀浆液、副性腺蛋白匀浆液、纳精囊和副性腺匀浆混合液处理精子,测定精子顶体酶活力。此外,对交配10小时后纳精囊内的游离精子测定精子顶体酶活力。结果表明:交配后纳精囊内的精子顶体酶活力最高,为(21.729±0.138)μIU/10~6;交配前胰蛋白酶消化得到的精子经不同处理后,发现副性腺蛋白和纳精囊混合匀浆液处理使精子酶活性有较大提高,而贮精囊匀浆液处理后精子酶活力与未处理的无显著性差异。三、中华绒螯蟹副性腺蛋白双向电泳及差异蛋白的质谱分析为了研究副性腺分泌物的功能,本研究运用双向电泳和质谱等蛋白质组学的方法分离中华绒鳌蟹副性腺发育早期和后期分泌的蛋白质。副性腺分泌蛋白经17cm2-dimensional SDS-PAGE,Coomassie blue染色后,多肽图谱用PDQuestsoftware分析。从这些蛋白斑点在凝胶中的分布位置来看,大多数分布在等电点pI4-7的范围内,主要蛋白质的分子量较小。对其中表达量有明显差异的13个蛋白点进行胶内酶解后质谱分析,初步鉴定出9种蛋白,这些蛋白主要参与精子获能;顶体反应和精卵结合;精子的保护包括精子抗氧化能力、精子损伤等;精子活力;转录及调节等方面。蛋白质的这些特性说明副性腺分泌物与精子结合后,在保持精子生理状态中起重要作用。由此构建的副性腺组织的蛋白质组学分析方法,对副性腺分泌物功能的进一步了解打下了基础。