研究背景肝移植是治疗许多终末期器质性肝病唯一而有效的治疗方法,但供体的缺乏使移植手术的适用范围受到很大的限制。我国每年有30多万病人死于各种终末期肝病,每年急需肝移植挽救生命的患者众多,而近年来,我国每年肝移植手术仅有2000例左右。美国器官移植的等待者和器官捐献者的比例为5：1,英国为3：1,而中国高达150：1。由于缺乏自愿捐献,中国此前绝大多数的移植器官来源于死囚捐献。我国以死囚尸体为来源的供肝在国际上受到争议,并且有日趋减少的趋势。而活体供体因涉及对供体有一定的损伤,故较难广泛开展。卫生部副部长黄洁夫近期表示,我国将尽快建立器官捐献体系,公民逝世后器官捐献应该成为中国器官移植的主要来源,在3-5年内改变主要依靠死囚来获得移植器官的方式。尸体供肝除来源于死囚供体外,还来源于公民逝世后的器官捐献,包括心脏死亡供体(donors of cardiac death, DCD)和脑死亡供体(donors of brain death, DBD)。虽然脑死亡供体的肝脏质量较高,但我国目前脑死亡尚未立法,难以广泛开展脑死亡供体的肝移植。而心脏死亡供体的肝脏活力虽然可能有不同程度的下降,但现阶段我国的医学界和法律界仍以心脏死亡作为判断死亡的主要标准,故来源于心脏死亡供体的供肝,虽只占目前我国供肝的较小部分,但却是未来发展的重点和趋势之一。公民心脏死亡后器官捐献将逐步成为中国器官移植的主要来源。1995年国际无心跳供体研讨会制定了马斯特里赫特(Maastricht)分类标准,该标准将供体分为5类：Ⅰ类：入院时已死亡者,属于“不可控制”型。Ⅱ类：心肺复苏失败者,属于“不可控制”型。Ⅲ类：等待心脏停跳的濒死者,未达到脑干死亡标准的即将死亡病人,治疗无望的病人,预测撤除支持治疗后短时间内很快会发生心脏停跳,可见于神经外科重症监护病房、一般重症监护病房、冠心病重症监护病房、创伤急诊病房和一般病房的病人,属于“可控制”型。Ⅳ类：病人在脑死亡的基础上发生心跳骤停,属于“可控制”型。Ⅴ类：危重病人发生意外的心脏骤停,属于“不可控制”型。卫生部目前正在力推心脏死亡后器官捐赠,已经颁布了《中国心脏死亡器官捐献指南》,倡导进行第Ⅲ类供体的院内器官捐献。心脏死亡供体的特点是供肝的热缺血损伤较明显,从撤除心肺支持设备到心跳停止、宣布死亡、切取肝脏,供体肝脏经历的热缺血时间较长,且常常经历多种不同的血流动力学状态,如低血压、缺血、淤血等。临床上迫切需要回答以下问题：如何评估此类供肝的热缺血损伤?如何减少供肝的热缺血损伤?心脏死亡供体的原发病不同,造成的血流动力学改变不同,为此,有必要研究不同的血流动力学状态单独对肝脏热缺血再灌注损伤的影响,了解其内在机制及干预因素。本研究即针对以上情况,借助大鼠肝脏热缺血模型展开。肝脏缺血的本质之一是缺氧,本实验选取了在组织缺氧损伤调控中扮演重要角色的缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)进行研究,检测不同的血流动力学状态下肝组织的HIF-1表达是否存在差异。通过使用干预HIF-1活性的药物,进一步验证HIF-1在不同血流动力学处理后肝脏热缺血再灌注损伤中的作用。实验分为以下三个部分。第一部分不同血流动力学状态对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的影响目的：对大鼠的部分肝脏进行热缺血处理,且针对该部分肝脏的不同血管(肝动脉、门静脉、肝静脉)分别进行阻断,来研究不同血流动力学状态,对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的影响。方法：108只SD大鼠随机分为3组：肝动脉阻断组(hepatic artery clamping group, HAC)、门静脉阻断组(hepatic portal vein clamping group, HPC)和肝静脉阻断组(hepatic vein clamping group, HVC),按50%肝脏血流阻断模型分别阻断以上血管,按阻断持续时间再分为15分钟、30分钟和60分钟(共分为9小组,每小组n=12)。主要研究指标：①缺血不同时间后,进行再灌注2小时、6小时、12小时、24小时和48小时,检测再灌注后不同时间血清ALT变化(每小组n=6)；②缺血不同时间后,进行再灌注6小时,检测血管阻断不同部位及时间对以下指标的影响：血清ALT、TB,肝组织MPO和MDA含量(每小组n=6)；③缺血30分钟后,进行再灌注6小时,检测不同血管阻断对以下指标的影响：肝组织病理学检查,活体荧光显微镜观察大鼠肝脏微循环状态,Real-time PCR方法检测肝组织TNF-α, IL-1, IL-6mRNA, TUNEL法原位标记肝细胞凋亡,ELISA检测Caspase-3活性,Western blot方法检测肝组织中凋亡相关蛋白(3小组,每小组n=6)；④所得数据以均数±标准差表示,用SPSS13.0进行统计学处理,均数的比较采用t检验及单因素方差分析。结果：本实验通过分别阻断大鼠部分肝脏的肝动脉、门静脉分支和肝静脉属支,建立了不同类型的肝脏血流阻断模型,模拟了心脏死亡供体肝脏常见的三种热缺血血流动力学状态：肝动脉低氧,肝组织缺血和肝静脉淤血。①三组大鼠肝脏经历不同时间热缺血后,血清ALT一般于再灌注后6小时达到峰值,此后逐渐下降；HVC组ALT显著高于HAC组和HPC组(P<0.01)；②血管阻断不同部位及时间对大鼠血清ALT、TB,肝组织MDA和MPO含量有明显影响：HVC组热缺血再灌注损伤程度较其他组明显加重,血流阻断60分钟组各项指标明显差于15分钟及30分钟组(P<0.05)；③不同血管阻断对以下指标有影响：肝细胞坏死、肝窦无灌注比例、肝组织TNF-α, IL-1, IL-6mRNA、肝细胞凋亡水平、Caspase-3活性、凋亡相关蛋白表达等均存在较显著差异,HVC组热缺血再灌注损伤程度较其他组明显加重(P<0.05)结论：不同的肝脏血流动力学缺血状态及其持续时间,对其后继再灌注损伤及其恢复有明显不同的影响。热缺血时间越长,肝脏再灌注损伤越严重,这种损伤在再灌注较早期就迅速表现出来。大鼠肝脏热缺血在不超过30分钟时,损伤相对较小而可逆,而超过60分钟后,损伤严重而较难逆转。肝脏热缺血时间最好控制30分钟以内。三组大鼠肝脏热缺血再灌注损伤存在较显著差异,肝静脉阻断组损伤程度较其他组明显加重。第二部分不同血流动力学状态对大鼠肝脏HIF-1差异表达的影响目的：观察大鼠肝脏不同血管阻断、热缺血后,肝组织局部微循环、氧供、能量代谢的情况,并重点研究肝组织HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表达、分布的特点,研究各组之间HIF-1α的差异。进一步研究经历不同血流动力学肝脏缺血再灌注后,各组大鼠肝功能和肝组织形态学改变的特点。方法：216只SD大鼠随机分为3组：HAC组、HPC组、HVC组,按50%肝脏血流阻断模型分别阻断以上血管,按阻断时间再分为15分钟、30分钟和60分钟(共分为9小组,每小组n=24,另设假手术组作为对照,不阻断血流)。主要研究指标：①缺血不同时间后即刻,取大鼠肝脏标本,进行HE染色病理学检查；缺血后即刻,活体荧光显微镜观察肝组织微循环情况；缺血后即刻,通过乏氧染色,检测肝组织氧合状态的变化及其分布特点,通过微透析法,检测肝组织葡萄糖、甘油糖原、乳酸和丙酮酸代谢水平(每小组n=6)；②肝脏缺血再灌注2小时后,Western blot和Real-time PCR的方法分别检测肝组织HIF-1α蛋白和mRNA的表达水平,免疫组化方法对HIF-1α表达进行组织定位,分析大鼠肝脏HIF-1α表达与缺氧、血管阻断不同部位及时间的关系(每小组n=6)；③缺血再灌注6小时后和24小时后,测定大鼠肝功能、肝组织MPO活性的变化,观察肝组织形态学的改变(每小组n=12)；④所得数据以均数±标准差表示,均数的比较采用t检验及单因素方差分析。结果：①缺血后即刻,随着血流阻断时间的延长,肝组织的损伤加剧,HAC组损伤较轻,而HVC组损伤较重,尤其是在经过60分钟的血流阻断后,出现较明显肝窦充血、肝细胞气球样变性和坏死；肝窦功能密度、肝窦内红细胞流速、肝组织血流等微循环指标、肝组织氧合和葡萄糖、甘油糖原、乳酸/丙酮酸(lactate/pyruvate, L/P)比值等代谢指标,HAC组优于HPC组,HPC组优于HVC组(P<0.05)；三组中肝组织乏氧染色阳性分布特点不同,HAC组和HVC组阳性染色集中于肝小叶中央静脉周围,HPC组集中于汇管区周围；②在HAC组或HPC组,细胞核中HIF-1α蛋白量增加明显(P<0.05),在HVC组,肝组织中检测到较少的HIF-1α蛋白,但其HIF-1α mRNA的表达出现了较明显的增加；在各实验组中,HIF-1α蛋白染色的阳性区域与乏氧染色的阳性区域一致,表明缺氧是HIF-1α蛋白在细胞核内聚集的触发因素；③再灌注后HVC组的损伤最重,在血流阻断60分钟、再灌注24小时后,HVC组肝组织出现了明显的形态学改变,肝细胞的坏死严重而广泛,呈现难以逆转的改变：肝小叶结构塌陷,肝窦充血,肝细胞变性；肝组织Suzuki评分HVC组最高(HAC、HPC、HVC组分别为0.83+0.04,2.21+0.59,3.89±0.08,各组间差异具有显著统计学意义,P<0.01)；再灌注24小时后,各组ALT回落,TB轻度升高,MPO降低。结论：肝脏的热缺血损伤与肝组织缺氧有关。肝脏缺氧导致了肝组织的微循环障碍和能量代谢改变。肝脏缺氧诱导了在血流阻断后再灌注早期,HIF-1α蛋白在细胞核内的聚集,但由于肝腺泡的血流分布特点,HIF-1α蛋白在不同血流动力学情况下,在各血流阻断组的表达量及分布部位存在差异。HIF-1α蛋白对肝组织热缺血再灌注损伤有保护作用,但对不同的血流动力学热缺血状态其肝脏保护程度不同。第三部分HIF-1干预对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的影响目的：通过2-甲氧基雌二醇(2-ME)抑制HIF-1α表达,观察肝组织缺血再灌注损伤是否加重,2-ME干预对不同的血流动力学缺血状态肝脏的影响是否不同,进一步验证HIF-1蛋白对肝脏热缺血再灌注损伤的保护作用和调控机制。方法：324只SD大鼠随机分为3组：HAC组、HPC组、HVC组,按50%肝脏血流阻断模型分别阻断以上血管,按阻断时间再分为15分钟、30分钟和60分钟,以上各小组大鼠再分为2-ME干预组和未干预组,干预组血流阻断前腹腔内注射2-ME,未干预组注射生理盐水(每小组n=18)。主要研究指标：①检测各组大鼠肝脏缺血30分钟再灌注6小时和24小时后血清ALT、TB (n=12);②缺血30分钟再灌注24小时后肝组织病理学检查(n=6)；③缺血15、30和60分钟再灌注2小时后肝组织HIF-1α蛋白表达(n=6)；④缺血15、30和60分钟再灌注6小时后肝组织MPO和MDA含量(n=6)；⑤缺血30分钟再灌注24小时后Real-time PCR方法检测肝脏HO-1、eNOS、 iNOS和A2AR mRNA表达(n=6)。⑥所得数据以均数±标准差表示,均数的比较采用t检验及单因素方差分析。结果：①2-ME干预减缓了各组大鼠缺血30分钟再灌注6小时后ALT下降的趋势,而加重了TB上升的趋势：干预后HAC组ALT由(218±10)U/L升高至(560+17) U/L, TB由(8.38+1.03)umol/L升高至(15.0+1.88)umol/L, HPC组ALT由(459+7)U/L升高至(847+27)U/L,TB由(17.3+2.22) umol/L升高至(23.1±1.37)umol/L,P<0.05；②2-ME干预加重了肝组织的热缺血再灌注损伤的病理形态学改变；③在HAC组和HPC组,在2-ME干预后,发现了HIF-1α蛋白量的表达减少,P<0.05。在HVC组,在2-ME干预后,HIF-1α蛋白量的表达有轻度增加；④2-ME干预后HAC组、HPC组MDA和MPO的含量升高了；⑤2-ME干预后,各组大鼠肝组织HO-1、A2AR和iNOS mRNA的表达水平与未干预前比较,存在差异,尤其在HPC组和HVC组较明显,P<0.05；在各组中,eNOS mRNA的表达水平在2-ME干预前后变化不明显。结论：使用HIF-1α的抑制剂2-ME,加重了肝脏的热缺血再灌注损伤,表现为肝功能变差,肝小叶结构完整性变差,肝脏中MDA和MPO含量升高。2-ME干预后,肝组织HIF-1α蛋白表达减少；2-ME干预对HAC-HPC组肝脏缺血再灌注损伤严重程度的影响较明显,对HVC组的影响较轻。HIF-1α对肝脏的保护作用,与其对下游靶基因的转录调控有关,相关的基因有HO-1、A2AR、iNOS等。HIF-1蛋白对肝脏热缺血再灌注损伤的影响和调控与这些基因有关。