非洲爪蟾视顶盖区突触前、后膜上谷氨酸能受体与r-氨基丁酸能受体的相互作用

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目的:在多种脊椎动物视觉发育的早期阶段都有一段关键期,在关键期内突触联系受外界环境的影响而发生变化,即为突触的可塑性。非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 是一种两栖动物,这种动物和高等动物相似,在视觉神经系统的突触形成和稳定方面,同样有敏感期或关键期。r-氨基丁酸(r-amino-butyric acid, GABA) 和谷氨酸 (glutamate, GLU) 是中枢神经系统最常见的抑制性和兴奋性神经递质。幼年爪蟾视顶盖区神经元的突触可塑性主要与N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受体有关,这种突触的改变存在于爪蟾视通路的峡核→同侧视顶盖的投射中。r-氨基丁酸能 (GABAergic) 的抑制作用在动物幼年时即已出现,GABA不仅在幼年动物的中枢神经系统 (CNS) 发生、分化、迁徙以及成熟过程中起营养作用,而且间接影响信号传递,并对中枢神经系统的发育可塑性也有重要作用。本实验旨在探讨幼年非洲爪蟾视顶盖区神经元突触前、后膜上兴奋性谷氨酸能受体与抑制性r-氨基丁酸能受体的相互作用,从而有助于揭示视觉发育的某些规律及突触间的传递机制。方法:应用盲法电压膜片钳全细胞记录技术,采用能完整保存突触结构的活脑片以研究突触膜上的受体活动。记录了幼年非洲爪蟾视顶盖区第六层神经元的自发性微突<WP=4>触后电流 (miniature postsynaptic currents, mPSCs),分别在灌流液中加入不同的激动剂 (agonist) 和拮抗剂 (antagonist)后,观察微兴奋性突触后电流(miniature excitory postsynaptic currents, mEPSCs) 和微抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs) 频率和振幅的变化。在计算机屏幕上观察受体激动剂和/或拮抗剂加入前后信号的变化,并将自发性突触后电流 (spontaneous postsynaptic currents, sPSCs) 记录在硬盘上,待实验结束后作离线分析。用Mini-analysis软件回放长时程记录数据,以6pA为阈值分析mPSCs在激动剂和/或拮抗剂灌流前、中、后的平均振幅(pA),以及mPSCs的发放频率(frequency),用Kolmogorov-Smirnov检验进行统计学分析,判断是否具有统计学上的差异。对加药前后两组细胞作t检验,P<0.05则认为具有统计学差异。结果:1加入谷氨酸受体激动剂NMDA (50-100(M) 灌洗脑片后先引起mIPSCs的频率增加,时间间隔累积分布曲线明显左移,经Kolmogorov-Smirnov检验有非常显著性差异 (P<0.05)。我们在以发放mIPSCs为主的6个神经元上均用NMDA灌流,发现灌流后mIPSCs的频率均明显增加,由灌流前的2.67±1.82Hz增加至灌流后的4.28±1.31Hz (配对t检验, P=0.004, n=6), 增加到对照值的248.9%。2 NMDA对膜电流的影响。在外源性NMDA引起mIPSCs频率增加后,细胞膜电流出现向内向方向的变化,并诱发出现mEPSCs,经正常灌流液冲洗后mIPSCs和mEPSCs均消失而膜电流逐渐上升最后恢复至原来未加NMDA的水平。3 BM对mPSCs的影响。在实验中还观察到,在脑片视顶盖<WP=5>区第六层神经元记录到mIPSCs,该神经元以发放mIPSCs为主,在灌流液中加入GABAa受体拮抗剂荷包牡丹碱(bicucullin, BM) (100(M) 后即可抑制由GABAa受体介导的mIPSCs,表现为原外向电流消失,这一结果是与mIPSCs的特性相符的。并可以诱发出现内向电流,随后在灌流液中加入谷氨酸类受体拮抗剂CNQX (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (50(M)后该内向电流消失,与mEPSCs的特性相符。表明BM抑制mIPSCs并诱发mEPSCs或使原有的mEPSCs频率明显增加。结论:幼年爪蟾视顶盖区突触膜上存在着两种受体:兴奋性谷氨酸能受体和抑制性γ-氨基丁酸能受体,两种受体间存在着相互作用,不同的神经元可能以其中的一种受体功能活动起主导作用,表现为实验中记录到的不同神经元以发放mIPSCs或mEPSCs为主。而且在突触前末梢可能存在NMDA受体并发挥突触前的调制作用,调节突触前末梢GABA等神经递质的释放。因此同一神经元的突触膜上的各种受体彼此相互制约,以确保突触前后活动和功能上的稳定,从而在不断变化的外界环境中通过稳态突触可塑性实现神经网络的平衡和稳定,并在视觉神经系统的正常发育中起到重要作用。
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