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病毒感染严重威胁人类的健康和生命安全。病毒入侵机体,诱发了宿主的抗病毒免疫反应。宿主细胞对病毒的识别及识别病原体成分后的免疫反应是宿主抗病毒免疫中的两个关键步骤。其中,γ干扰素诱导蛋白IFI16是一种独特的核酸识别受体,既可以帮助机体识别定位于胞核的病毒DNA,也可以识别定位于胞质的病毒DNA,继而参与宿主抗病毒免疫应答和炎症反应。IFI16至少有四种剪接异构体,分别为IFI16-iso1,2,3,4,其中以IFI16-iso2的结构和功能的研究较为清楚。IFI16-iso2主要定位于细胞核,识别核内复制的病毒DNA,如HSV-1,而对于胞浆复制的病毒DNA的识别,如VACV,IFI16-iso2亦可发生乙酰化,继而转运至胞浆进行有效识别。研究显示,IFI16-iso2的N端pyrin结构域主要介导分子间相互作用以及IFI16低聚物的协同组装,C端的两个HIN200结构域,可直接结合病毒DNA。我们的研究发现IFI16-isol编码的氨基酸序列长度与IFI16-iso2完全一致,但是在其N端的区域缺少了 NLS编码序列,在C端的两个HIN200结构域之间以额外的序列代替。目前关于IFI16-iso1对病毒DNA的识别及其在抗病毒免疫中的作用尚未报道。此外,病毒核酸被宿主细胞模式识别受体识别后,以IFN-I依赖或非依赖的方式触发宿主细胞抗病毒免疫信号,从而抵抗病毒入侵。有研究发现,固有免疫系统的活化需要消耗大量的生物大分子及代谢中间产物。细胞代谢的方式参与了免疫细胞的增殖、分化以及活化等,例如葡萄糖和丝氨酸的代谢,胆固醇和色氨酸的合成。其中,有文献报道,病毒感染的细胞和活化的免疫细胞均倾向于糖酵解的方式供能,因此,选择性靶向细胞的糖酵解途径将是宿主抵抗病毒感染的有效策略。一方面,为了研究IFI16-iso1在病毒DNA的识别和抗病毒免疫反应中的作用及其与IFI16-iso2的功能差异,我们采用了新型的病毒DNA模拟物及两种不同亚细胞定位的活病毒进行分析。首先,通过免疫荧光分析了外源过表达的IFI16-iso1和IFI16-iso2在细胞内的定位。紧接着,我们应用商品化的病毒DNA模拟物来进行分析,但是由于目前商品化的病毒DNA模拟物若利用常规的转染技术只能进入细胞质,不利于核内DNA受体信号的活化,因此我们对其核酸序列进行改造,并对改造前后的模拟物进行分析。在此基础上,利用改造前后的病毒DNA模拟物以及不同胞内复制的DNA病毒来分析IFI16-iso1和IFI16-iso2在病毒DNA的识别和抗病毒免疫中的差异。此外,通过RT-qPCR和Western blot初步分析IFI16-iso1和IFI16-iso2对DNA病毒诱导的免疫反应的差异。最后,采用TCID50检测过表达IFI16-iso1或IFI16-iso2的细胞上清中病毒的含量,以评估二者抗病毒能力的差异。另一方面,为了研究细胞糖酵解代谢对宿主抗病毒免疫的影响,我们从体内外多个层面进行了分析。首先,通过转录组测序分析了寨卡病毒感染或流感病毒感染的病人PBMC细胞的差异表达基因,发现糖酵解的关键限速酶PFKFB3显著被上调;紧接着,通过RT-qPCR、Western blot和荧光素酶报告基因系统检测了多种病毒刺激后PFKFB3的表达以及可能调控PFKFB3表达的上游信号分子,揭示其可能作为ISG参与宿主的抗病毒免疫反应。紧接着,采用瞬时过表达或稳定高表达的细胞系分析PFKFB3在体外的抗病毒作用;同时,采用PFKFB3小分子抑制剂3PO或应用Cre-Loxp系统构建髓系细胞特异性的Pfkfb3-/-小鼠,RT-qPCR和TCID50检测不同病毒感染后,小鼠的脏器、血清及肺泡灌洗液中病毒的含量;HE染色观察病毒感染后小鼠的组织损伤程度及炎症浸润情况;监测小鼠的生存状况等以综合评估PFKFB3在体内的抗病毒作用。收集PFKFB3及其酶活性突变质粒过表达后的细胞培养上清,即条件培养基,通过流式细胞术、RT-qPCR和TCID50检测感染前后细胞内及细胞培养上清中病毒的含量。质谱技术分析PFKFB3条件培养基中的氨基酸的含量;在此基础上,通过RT-qPCR和Western blot检测氨基酸代谢相关酶如ARG1和NOS2的变化。构建相应的截短体质粒,结合免疫共沉淀、免疫荧光及PLA临近结合技术分析蛋白之间的互作关系;应用真核及原核表达体系,纯化得到带有Flag或GST标记的PFKFB3蛋白、STAT1蛋白、STAT6蛋白以及相应的截短体蛋白,并结合Western blot检测体外反应体系中蛋白的活化情况以探究PFKFB3发挥抗病毒作用的具体的作用机制。本研究中,首先我们发现了 IFI16-iso1具有与IFI16-iso2相同数量的氨基酸,但是缺乏NLS的氨基酸序列,并且IFI16-iso1主要定位于细胞质内。其次,为了进一步区分IFI16-iso1和IFI16-iso2的功能,我们开发了新的核内病毒DNA模拟物,即合成的6个碱基的核苷酸基序（5’-AGTGTT-3’）可以有效地将原有的商品化的病毒DNA模拟物从细胞质带入细胞核内,并且被核内受体有效地识别,如IFI16-iso2和hnRNPA2B1,进而促进细胞内IFN-β及抗病毒ISGs的表达。在此基础上,我们发现IFI16-iso1和IFI16-iso2的亚细胞定位不同导致二者在病毒DNA的识别及诱导的抗病毒免疫反应的差异显著,即IFI1 6-iso1偏好与细胞质内复制的DNA病毒如VACV,及胞质病毒DNA模拟物如HSV60mer,在细胞质内发生共定位,而IFI16-iso2则更偏好与细胞核内复制的DNA病毒如HSV-1,及核内病毒DNA模拟物如HSV60-DNLS发生共定位。相较于IFI16-iso2,IFI16-iso1在识别HSV60mer或VACV后,更显著地诱导的IFN-β以ISG的转录,表现为更有效地抗病毒免疫反应。由于核质穿梭的能力,IFI16-iso2除了清除HSV-1,也能有效抵抗VACV的入侵。但是,在HSV60-DNLS或HSV-1刺激后,IFI16-iso2介导的IFN-I依赖的抗病毒免疫显著强于IFI16-iso1诱导的免疫反应。最后,我们发现PFKFB3能被多种病毒及模拟物诱导表达,提示其可能作为ISG参与了宿主的抗病毒免疫反应。功能实验表明体外过表达PFKFB3能显著抑制多种病毒在细胞内的复制;小鼠体内实验也显示髓系细胞中Pfkfb3的特异性缺失或药物抑制PFKFB3的酶活性后促进了脏器、血及肺泡灌洗液中病毒的复制,加重了组织损伤,最终导致小鼠生存率显著降低,表明PFKFB3在体内外均发挥显著的抗病毒活性。同时,我们发现PFKFB3的条件培养基也表现显著的抗病毒活性,并且不依赖IFN-I信号。氨基酸代谢质谱的结果显示PFKFB3条件培养基中了精氨酸的含量显著降低;但是在病毒感染的Pfkfb3髓系细胞特异性敲除小鼠的肺泡灌洗液以及BMDM细胞上清中,精氨酸的含量却明显增加,表明PFKFB3通过下调精氨酸的含量从而抵抗病毒入侵。机制的实验结果显示,PFKFB3的激酶结构域可以直接结合并活化STAT1和STAT6,进而促进精氨酸代谢酶Arginase1和iNOS的表达,最终消耗了精氨酸,发挥显著的抗病毒活性。总的来讲,本研究开发了一种新的核内DNA受体激动剂;发现了 IFI16-iso1在病毒DNA的识别和抗病毒免疫中的作用;此外结合病毒DNA模拟物及相应的病毒,证明了IFI16-iso1和IFI16-iso2在宿主抗病毒免疫中扮演着不同的角色;最后,我们发现了 PFKFB3基因本身及其条件培养基均具有明显的抗病毒活性,并且通过了 PFKFB3的激酶结构域与STAT1或STAT6直接相互作用,活化,进而促进下游基因的表达,调控精氨酸的消耗,最终抵抗病毒感染。